【摘 要】
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泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）是细胞内介导蛋白降解的水解体系,可通过调控细胞中蛋白泛素化进程参与多种生命活动。UPS降解蛋白是一个三酶级联反应,在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3共同作用下将泛素分子转移到靶蛋白上,对其进行泛素化修饰。泛素化的靶蛋白最终在蛋白酶体内降解。在整个泛素化过程中,E3泛素连接酶对靶蛋白的特异性识别起关键主导
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泛素蛋白酶体系统（ubiquitin-proteasome system,UPS）是细胞内介导蛋白降解的水解体系,可通过调控细胞中蛋白泛素化进程参与多种生命活动。UPS降解蛋白是一个三酶级联反应,在泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3共同作用下将泛素分子转移到靶蛋白上,对其进行泛素化修饰。泛素化的靶蛋白最终在蛋白酶体内降解。在整个泛素化过程中,E3泛素连接酶对靶蛋白的特异性识别起关键主导作用。S期激酶相关蛋白2（S-phase kinase associated protein 2,Skp2）是SCF类（Skp1-Cullin1-F-box）E3泛素连接酶识别底物的反应原件,有研究表明Skp2在多种癌症中高表达且与肿瘤的不良预后密切相关。Skp2主要通过降解周期蛋白依赖性激酶抑制因子（Cyclin-dependent kinase inhibitor,CKIs）如p27,p21和p57等,进而调节肿瘤增殖和转移。Skp2在Cks1（Cyclin-dependent kinases regulatory subunit 1）参与下可以直接降解磷酸化的p27,促进肿瘤细胞的增殖。因此通过靶向Skp2-Cks1相互作用的小分子化合物来抑制p27的泛素化降解是一种有效的新型抗癌策略。本论文建立了靶向Skp2-Cks1小分子抑制剂的高通量筛选平台,通过对课题组已有的化合物库进行筛选,在得到先导化合物Selexipag的基础上并对其结构进行优化。通过初步的抗肿瘤生物活性评价,我们发现化合物ZK-288对多种Skp2高表达的肿瘤细胞表现出较强的抗肿瘤活性,在PC-3前列腺癌细胞和MGC-803胃癌细胞中其IC50为4.76μM和7.06μM。随后,我们在PC-3和MGC-803细胞中进行了深入的抗肿瘤机制探究。通过细胞热迁移实验、Skp2-sh RNA实验和免疫共沉淀实验证明化合物ZK-288在细胞内能靶向Skp2与Cks1的结合。Western Blot实验表明化合物ZK-288能以时间依赖和浓度依赖的方式抑制Skp2底物p21和p27的蛋白降解。Hoechst 33342染色和AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡实验进一步证实了化合物ZK-288能够以浓度依赖的方式诱导PC-3和MGC-803细胞凋亡的发生。细胞周期实验显示化合物ZK-288可以阻滞细胞周期于S期,抑制肿瘤细胞的增殖。小鼠体内抗肿瘤活性研究表明化合物ZK-288可以显著抑制PC-3和MGC-803肿瘤的生长,且未显示出明显的毒副作用。以上结果表明化合物ZK-288在细胞与动物水平均具有较强的抗肿瘤活性,可以用于靶向Skp2抗肿瘤药物的研发。
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