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目的:
1、检测线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)突变在甲状腺恶性肿瘤(malignant thyroid carcinomas，MTC)和良性肿瘤(benign thyroid adenomas，BTA)患者中的发生情况;预测mtDNA错义突变对线粒体基因编码蛋白的结构和功能的影响;分析mtDNA蛋白亚基基因突变碱基比。
2、分析mtDNA突变与甲状腺肿瘤的相关性。
3、分析MTC和BTA患者mtDNA单体型分布，以期从分子水平揭示线粒体遗传背景对mtDNA突变和甲状腺肿瘤的影响。
方法:
1、标本采集:在温州地区，随机采集73例甲状腺肿瘤患者冰冻病理组织切片，和其外周静脉血。其中MTC患者冰冻病理组织切片包括肿瘤组织和肿瘤旁组织，BTA患者冰冻病理组织切片只包含肿瘤组织。73例甲状腺肿瘤患者包括MTC患者55例（甲状腺滤泡状恶性肿瘤1例和甲状腺乳头状恶性肿瘤54例）和BTA患者18例（腺瘤型结节性甲状腺肿1例和甲状腺腺瘤17例），以BTA患者为对照组。同时采集患者的临床资料。
2、全基因组DNA提取:普通光学显微镜下区别和分离冰冻病理组织切片（肿瘤组织和肿瘤旁正常组织），采用酚-氯仿法手工提取肿瘤组织和肿瘤旁组织的全基因组DNA和外周血DNA。
3、PCR扩增mtDNA:设计20对重叠连续引物PCR扩增mtDNA全序，并测序，逐个分析每个编码基因（包括D-Loop区）。
4、突变位点和多态性位点分析:以剑桥序列为参考，运用软件CodoncodeAligner筛查mtDNA突变位点和多态性位点，并以反向测序验证。应用Cluxtal分析变异氨基酸保守性，SOSUI预测变异蛋白二级结构和PolyPhen-2预测错义突变对相应蛋白的结构和功能的影响。
5、统计分析:运用统计学方法分析mtDNA突变与mtDNA单体型之间的关系，同时结合临床资料分析mtDNA突变、mtDNA单体型与甲状腺肿瘤的关系。
结果:
1.55例MTC患者中有32例患者发生mtDNA突变(58.2％)，共38个mtDNA突变，12个破坏性突变，22个潜在破坏性突变。其中有5个患者携带2个或2个以上mtDNA突变。复合物Ⅰ中发生22个mtDNA突变，7个为破坏性突变，14个为潜在破坏性突变;复合物Ⅲ中发生7个mtDNA突变，1个为破坏性突变，4个为潜在破坏性突变;复合物Ⅳ中发生8个mtDNA突变，4个为破坏性突变，4个为潜在破坏性突变;复合物Ⅴ中发生1个良性mtDNA突变。共30例MTC患者携带34个恶性突变。
2.18例BTA患者中有4例患者发生mtDNA突变(22.2％)，共4个mtDNA突变。2个为破化性突变，2个为潜在破坏性突变，共4个恶性突变。
3.统计学分析发现，mtDNA恶性突变在MTC组和BTA组之间差异显著(P=0.017)。在男性和女性组中mtDNA潜在破坏性突变具有显著性差异(P=0.015)。
4.我们的研究结果显示，COI具有最高恶性突变碱基比，为5.19×10-3，CytB具有最高总突变碱基比，为6.13×10-3。
5.55例MTC患者中M单体型22例，其中D亚单体型最多为13例;N单体型33例，其中R亚单体型最多，为25例。18例BTA患者中M和N单体型分别为9例。单体型在MTC患者和BTA患者之间无统计学差异。
6.统计学分析MTC组中mtDNA突变在M和N单体型间的差异，结果显示mtDNA恶性突变和mtDNA潜在破坏性突变在两个单体型中具有显著性差异，P值分别为0.027和0.008。
结论:
1.本研究发现甲状腺肿瘤患者mtDNA突变以恶性突变为主，大部分恶性突变发生在线粒体呼吸链复合物亚基基因上，特别是复合物Ⅰ，这可能导致线粒体氧化磷酸化功能异常，增高肿瘤细胞ROS水平，促进肿瘤细胞生长。将两组患者进行比较，MTC组mtDNA恶性突变率高于BTA组，且该突变病例数在两组间具有显著性差异(P=0.017)，以现有数据推测，mtDNA恶性突变可能增加甲状腺恶性肿瘤发病风险。经突变碱基比分析发现，COI基因最易遭受恶性突变，而CytB基因是最易发生突变基因。考虑到该研究局限于DNA分子水平，因此更深入的研究应继续开展以验证该结论。
2.在本研究样本例数和地域范围内，mtDNA潜在破坏性突变在男性患者和女性患者中具有显著性差异(P=0.015)，男性患者mtDNA潜在破坏性突变率高于女性患者，据此推测，mtDNA潜在破坏性突变与男性患者可能存在某种相关性，因受本研究病例数太少影响，需扩大标本量进一步研究。
3.通过单体型分析后发现，在55例MTC患者中，mtDNA恶性突变和潜在破坏性突变在M和N单体型间都具有统计学意义，P值分别为0.027和0.008，且在M单体型中mtDNA恶性突变率和mtDNA破坏性突变率均高于N单体型，据此推测M单体型可能增加mtDNA恶性突变率和mtDNA破坏性突变率。考虑到我们所采集标本的区域性和数量，该结论需要扩大标本量在不同地区和人群中进一步确定。