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大肠杆菌(Escherichia coli)依据其遗传特性和临床表现共分为三类：共生型大肠杆菌,肠道致病性大肠杆菌以及肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli, ExPEC)。ExPEC在近些年已经成为广泛威胁全球人类和动物健康的致病菌,在人体内主要能引起肾盂肾炎和新生儿脑膜炎,在禽致病方面,主要引起败血症、气囊炎和心包炎等,在猪致病方面,主要引起脑膜炎、肺炎和败血症。因肠外致病性大肠杆菌的血清型、毒力因子、基因结构和基因表达调控的错综复杂性,对ExPEC的致病机制还没完全研究清楚。在2004-2007年间,本实验室对已分离鉴定正确的315株猪肠外致病性大肠杆菌流行病学研究中,发现其优势血清型为O11、08、O101、0138、0161、026,优势群系为B2和D群系。荚膜是覆盖在细菌表面的主要多糖结构,能够保护细菌免受宿主免疫系统的清除。2群型表达荚膜的基因组kps基因位点是由3个区域组成的一个保守性结构。kpsM是枷基因簇区域3中高度保守的一个基因位点,编码ABC转运蛋白中横跨内膜的通道蛋白。本实验室对已测序的猪肠外致病性大肠杆菌强毒株PCN033和弱毒株PCN009进行基因组学和比较基因组学分析,发现kpsM基因存在于PCN033中,而PCN009中没有,在此基础之上,本实验室以强毒株PCN033为亲本菌,其血清型为O11,D群系。通过同源重组的方法缺失kpsM基因,开展kpsM基因的功能和生物学特性的研究,主要研究内容包括：1.△josM基因缺失菌株的构建及鉴定从PCN033中扩增kpsM的上下游同源臂,将得到的上下游同源臂分别连接到pMD-18T载体上。将上下游同源臂酶切回收后同时连接到中间转移质粒pSK上,构建穿梭载体pSK△kpsM。然后将同源臂酶切回收后连接到重组自杀性质粒pRE112上,构建重组转移质粒pRE112△kpsM。以转化了重组转移载体pRE112△kpsM的x7213为供体菌,猪肠外致病性大肠杆菌PCN033为受体菌进行接合转移,采用基于Cm正向筛选和SacB蔗糖负向筛选并结合两步交换同源重组的方法构建基因缺失株。通过PCR鉴定和Southern blot验证,结果表明基因缺失突变株构建成功。2.△kpsM互补菌株(△kpsM-kpsM)的构建及鉴定从PCN033基因组中扩增kpsM目的基因,将其连入穿梭质粒pHSG396,构建重组表达载体pHSG396-kpsM,将重组质粒电转化入△kpsM菌株中,获得互补菌株△kpsM-kpsM,使用PCR对其进行验证,结果表明互补菌株构建成功。3.基因缺失突变株和互补菌株生物学特性分析将△kpsM缺失菌株(?)△kpsM-kpsM互补菌株分别在平板上连续传10代,每代都应用PCR鉴定其遗传稳定性,结果表明,△kpsM和△kpsM-kpsM都能够稳定的遗传；菌株生长速率测定试验,绘制△kpsM、PCN033和AkpsM-kpsM的生长曲线图,结果表明,△kpsM和△kpsM-kpsM与亲本菌PCN033比较,生长速率没有显著差异；小鼠感染试验及LD5o的测定结果显示,与亲本菌PCN033比较,△kpsM的毒力降低了14.75倍,其互补菌株△kpsM-kpsM与亲本株相比毒力没有完全恢复,只是恢复了大约75%的毒力。在细胞黏附试验、细胞吞噬试验和血清杀菌试验中,△kpsM与亲本菌PCN033相比,其粘附能力下降了80%,抗吞噬能力下降了40%,抵抗补体介导的血清杀菌能力下降了55.12%；△kpsM-kpsM与PCN033相比,其粘附能力恢复了73%,抗吞噬能力恢复了80%,抗血清杀菌能力恢复了100%。