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实验目的:1、建立C57/BL小鼠的lewis肺癌模型2、观察RT联合PD-1抑制剂联合CpG-ODN的三联疗法的抗肿瘤效果。3、对三联疗法抗肿瘤作用的机制进行初步探索。实验方法:建立荷瘤小鼠模型,右后肢皮下种植作为primary肿瘤,左背部皮下种植作为secondary肿瘤。待右后肢瘤体长到直径为5mm左右时,对荷瘤小鼠进行随机分组,分为6组(A.B.C.D.E.F)A组:空白对照Control。B组:单纯放疗RT。C组:RT联合PD-1 blockade。D组:RT联合CpG-ODN。E组:PD-1 blockade联合CpG-ODN。F组:三联疗法组。隔天使用电子游标卡尺对肿瘤大小进行测量为观察。部分小鼠用于生存时间的观察,观察到第80天。部分小鼠于第24日处死以收获脾脏和完整肿瘤组织,采用研磨法获得单细胞悬液,采用酶消化法提取肿瘤浸润淋巴细胞(TIL),流式细胞术检测脾脏和TIL中的CD8~+T/CD4~+T细胞淋巴细胞的频率以及表型,检测CD8~+T细胞分泌的IFN-γ和TNF-α,从而分析CD8~+T淋巴细胞功能。同时,还检测了肿瘤浸润树突细胞的成熟和活化。此外,检测了脾脏和TIL中CD4~+Foxp3~+Treg细胞的频率。为直观观察三联疗法的作用效果与CD8~+T细胞与CD4~+T细胞的关系。另设G组:三联疗法+CD8~+Tcell抑制抗体组,H组:三联疗法+CD4~+Tcell抑制抗体组。对三联疗法组出现“完全肿瘤消退”的荷瘤小鼠采取大剂量肿瘤细胞冲击眼验证荷瘤小鼠的免疫记忆型。实验结果:三联疗法组的荷瘤小鼠出现了明显的肿瘤生长抑制,甚至出现“完全的肿瘤消退”,且这种抗肿瘤作用具有系统性,并明显延长了小鼠的生存时间。在联合治疗组可以观察到CD8~+T cell比例的明显增高,增高的表型主要为效应记忆型,而在CD8~+T cell删除组,联合治疗的效果则明显降低。进一步分析发现不仅CD8~+T cell的比例明显增加,其活化和对肿瘤的杀伤能力也大幅度提高,表现为分泌的IFN-γ和TNF-α增多。我们还在三联疗法组检测到肿瘤浸润树突细胞的活化增强。此外,联合治疗还使得具有负性调节作用的调节性T细胞的比例下降,进一步加强了机体的抗肿瘤效果。联合治疗还具有有效的免疫记忆性,在冲击接种后,略见瘤体出现,随即肿瘤消退。不仅如此,三联疗法对荷瘤小鼠的血象影响和其肺毒性甚微。实验结论:三联疗法能有效抑制肿瘤的生长,明显延长了小鼠的生存时间,增强了CD8~+T细胞的的频率和功能,加强了肿瘤浸润树突细胞的成熟活化,并且能减弱肿瘤局部Treg细胞免疫抑制功能。此外。在有效的抗肿瘤作用的基础上,其安全性也得到了肯定,使得这种新型治疗策略更具有临床意义和价值。