土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolyspora spinosa)产生的次级代谢产物多杀菌素(Spinosyns)是一种新型大环内酯类天然产物,具有高效生物杀虫活性,是理想的绿色生物杀虫剂。但是野生刺糖多孢菌合成多杀菌素的能力较弱、产量极低,因此,利用基因工程技术定向改造刺糖多孢菌,有望成为提高多杀菌素产量的有效方法。本研究利用PCR扩增了环腺苷酸受体蛋白基因crp和细胞分裂激活因子基因ssgA,利用酶切、连接的方法将crp与ssgA分别置于红霉素增强型启动子PermE的控制之下。随后利用Red/ET同源重组技术将PermE-crp基因片段和PermE-ssgA基因片段分别亚克隆到本室构建的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建获得重组载体pUC-spn-PermE-crp和pUC-spn-PermE-ssgA。通过接合转移方法将重组载体分别导入刺糖多孢菌中,利用单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,获得了遗传性能稳定的重组工程菌株S.spinosa-Crp和S.spinosa-SsgA。借用扫描电子显微镜观察工程菌株菌丝体形态变化,结果显示,工程菌株S.spinosa-SsgA菌丝片段化程度较对照菌株高,并形成了一定数量的孢子隔膜;采用高效液相色谱检测多杀菌素生物合成情况,摇瓶发酵结果表明,与对照菌株相比,工程菌株S.spinosa-Crp中的多杀菌素产量提高1.28倍,工程菌株S.spinosa-SsgA中多杀菌素产量与对照菌株相比提高了 1.55倍;RT-qPCR结果显示工程菌中相应基因的转录水平上调。这些结果表明crp与ssgA的过表达对刺糖多孢菌的形态及生长产生了一定的影响,并有效地促进了刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成。丁烯基多杀菌素(butenyl-spinosyns)由须糖多孢菌(Saccharopolyspora pogona)产生,分子结构与多杀菌素高度类似,其杀虫活性与多杀菌素相比更高,但野生型须糖多孢菌菌株中丁烯基多杀菌素的产量极低。3’-O-甲基鼠李糖是丁烯基多杀菌素发挥活性的重要组成成分,同时也是该菌株细胞壁的组成成分。为了提高丁烯基多杀菌素合成关键底物3’-O-甲基鼠李糖的合成,本研究扩增了三段分散排列在刺糖多孢菌基因组上的鼠李糖生物合成基因gtt、epi和gdh+kre,并将其克隆至大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pJN100上,构建成鼠李糖表达载体pJNRM;通过接合转移方式将其导入须糖多孢菌菌株中,获得了鼠李糖生物合成基因加倍的工程菌株SPOG-RM。PCR鉴定结果表明,该质粒已成功地整合至须糖多孢菌基因组上;实时荧光定量PCR结果显示,工程菌中gtt、epi、kre和gdh基因的转录水平分别比原始菌株提高了54.1倍、26.8倍、14.0倍和11.9倍;HPLC检测结果表明,重组工程菌SPOG-RM中丁烯基多杀菌素产量比原始菌株提高了214%。总之,本研究通过定向遗传改造的方法,首次实现了正调控基因crp和ssgA的在刺糖多孢菌中的过表达,以及鼠李糖生物合成基因在须糖多孢菌菌株中的过表达,有效地促进了多杀菌素及丁烯基多杀菌素的生物合成,证明了此方法的高效可行性,为通过其它正调控基因或限速酶基因的超量表达提高多杀菌素及其类似物的生物合成奠定了重要基础。