目的本实验在前期研究的基础上,拟从白芥子散对哮喘大鼠免疫因子的调控角度,以及通过全转录组测序建立基因功能表达谱数据库,筛选与哮喘大鼠免疫系统相关通路,为白芥子散穴位贴治疗哮喘提供实验依据。方法首先进行预实验,通过病理学观察肺组织相关病理改变,镜下观察模型组肺组织可见大量炎症细胞的浸润,并存在肺泡与间质充血、水肿现象,证明造模成功。继而进行正式实验。将雄性清洁SD大鼠36只,4~6周龄,体重(150±20),按均衡随机法(按体重分层)分为6组,分别为正常组(A组)、模型组(B组)、给药组内分为三个不同剂量组:高剂量给药组(C组)、中剂量给药组(D组)、低剂量给药组(E组),每组实验动物6只,剩余一组大鼠备用。第1天,模型组、三个不同剂量给药组两共四组分别用新鲜配制的OVA,100mg辅以氢氧化铝凝胶200mg及生理盐水1ml混悬液在大鼠两腹股沟、后足跖,共4点做皮下注射,每点0.2ml,同时腹腔注射0.2ml,正常组不做任何处理。第15~24天三个给药组开始进行白芥子贴贴敷治疗,穴位贴敷前用8%硫化钠在穴位处脱毛,将药丸放在医用脱敏胶贴上,分别贴于大鼠肺俞(双)、定喘、膻中、膏肓(双)处,每天1次,每次贴敷2~4h,贴敷治疗后,将给药组致敏的大鼠置于密闭容器内用超声雾化器雾化吸入1%OVA生理盐水悬液,每天30min,进行激发诱喘1次,连续10天。模型组6只大鼠予以空白贴敷,处理方法同给药组。正常组、备用组自由进食常规饲料和水。第25天处死大鼠,采集肺组织标本完成病理检测,并进行RNA的提取及鉴定、全转录组测序的检测,并筛选与哮喘大鼠免疫系统相关通路。结果1.镜下观察病理切片,可以发现:正常组大鼠肺泡结构正常,肺泡壁厚度呈正常状态;模型组可见肺泡壁结构明显受损,可见大量黏膜上皮细胞脱落,黏液栓分泌增多,符合哮喘的病理学表现,由此证明造模成功。模型组与三个给药组进行对比:高剂量组支气管管腔未见明显狭窄,肺泡区域的炎性细胞浸润也明显减少;中剂量组可见部分肺泡壁呈增厚状态,支气管腔狭窄程度也出现减轻;低剂量给药组肺泡腔较模型组稍有变大,炎性细胞浸润程度较模型组缓解。通过比较,白芥子散高剂量给药组在治疗后症状明显得到改善;中低剂量组也均有改善,但效果不及高剂量给药组。由此可以看出,白芥子散穴位贴敷治疗哮喘有明显疗效,且高剂量组治疗效果更佳。2.对各组大鼠肺组织MMP-9灰度值测定,实验结果分析:与正常组比较,模型组大鼠肺组织中MMP-9灰度值明显降低(P<0.001)。与模型组比较,给药组高、中、低剂量组大鼠肺组织中MMP-9灰度值明显升高(P<0.01);对各组大鼠肺组织IL-4灰度值进行测定结果分析:与正常组比较,模型组大鼠肺组织IL-4灰度值明显降低(P<0.001)。与模型组比较,给药组高、中、低剂量组IL-4灰度值明显升高(P<0.001);对各组大鼠肺组织TGF-β1灰度值分析:与正常组比较,模型组大鼠肺组织TGF-β1灰度值显著下降(P<0.001)。与模型组比较,给药组高剂量组TGF-β1灰度值(P<0.001),给药组中剂量组TGF-β1灰度值(P<0.05),给药组低剂量组TGF-β1灰度值与模型组对比无统计学意义。3.取大鼠肺组织提取RNA,进行全转录基因测序,通过全转录组数据,在高中低剂量组分别找到401,381,402个差异表达的mRNA,通过趋势分析,将所得差异mRNA进一步通过趋势分析进行筛选,得到206个随着剂量变化而表达持续变化的基因,并进行GO、KEGG富集分析。通过条件筛选,白芥子散治疗哮喘主要涉及的功能条目有辅因子代谢过程、解剖结构形态发生、免疫系统过程、细胞凋亡等,且白芥子散在免疫系统方面主要通过IL-17信号通路、造血细胞谱系、Th17细胞分化、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、Th1和Th2细胞分化等18条相关通路治疗哮喘。结论1.哮喘大鼠在行为学以及病理学方面均有明显改变,揭示了白芥子散穴位贴敷治疗哮喘效果显著。2.大鼠肺组织中免疫因子MMP-9、IL-4及TGF-β1灰度值检测,哮喘大鼠肺组织中MMP-9、IL-4及TGF-β1数值均上升,白芥子散穴位贴敷治疗后,三个指标均呈下降趋势,高剂量给药组三个指标数值下降最多,说明白芥子散对哮喘治疗有效,且高剂量组治疗效果更佳。3.大鼠肺组织全转录基因测序数据进行GO功能富集分析:白芥子散治疗哮喘主要涉及的功能条目主要有辅因子代谢过程、解剖结构形态发生功能、免疫系统过程、细胞凋亡等方面;KEGG富集分析:白芥子散在免疫系统方面主要通过IL-17信号通路、造血细胞谱系、Th17细胞分化、Toll样受体信号通路、NOD样受体信号通路、Th1和Th2细胞分化等18条相关通路治疗哮喘。