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口蹄疫(foot and mouth disease,FMD)是由口蹄疫病毒引起的偶蹄动物的一种急性热性高度接触性传染病;羊痘(capripox,CP)是由绵羊痘病毒和山羊痘病毒引起的绵羊和山羊的一种急性、热性、接触性传染病。口蹄疫和羊痘均因危害严重而被世界动物卫生组织列为A类重大传染病。痘苗病毒(fowl pox viruses , FPV)载体是研究最早和最成功的载体病毒之一,具有宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因组容量大、含多个非必需区等优势,有利于进行基因工程操作和插入多个外源基因,且抗原性稳定、免疫原性持久,能够同时诱发体液和细胞免疫,相对安全。本文利用我国广泛使用的山羊痘疫苗弱毒株(AV41),以胸腺嘧啶核苷激酶基因(TK)为突破点,利用病毒在细胞内的同源重组,构建表达O型FMDV P1-2A、3C基因的重组山羊痘病毒弱毒株。构建一个能够同时预防口蹄疫和羊痘病毒的活载体疫苗。(1)利用RT-PCR分别扩增口蹄疫病毒O/China99毒株的P1-2A和3C基因,将P1-2A基因连接到pUC119载体,3C基因连接到pMD18-T载体,得到重组载体pUC119-P1-2A,pMD18-T-3C。将重组载体pUC119-P1-2A用HindⅢ、BamHI酶切、重组载体pMD18-T-3C用BamHI、NheI酶切,利用酶切所得基因片段P1-2A、3C有共同的BamHI酶切位点,实现基因P1-2A、3C的连接,构建重组载体pMD18-T-P1-2A-3C。然后将基因P1-2A-3C与启动增强型绿色荧光蛋白( Enhanced Green fluorescent protein ,EGFP)表达的双向串连痘苗病毒启动子P7.5相连,构建了包含真核基因表达元件和筛选标记基因的表达盒载体p-EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C。以kpnⅠ为插入位点,将整体表达盒插入山羊痘病毒转移载体骨架pUC119-TK之中,构建了共表达FMDV P1-2A-3C基因和绿色荧光蛋白基因的重组山羊痘病毒转移载体pUC119-TK-P7.5-EGFP-P1-2A-3C。(2)病毒转移载体pUC119-TK -EGFP-N1-P7.5-P1-2A-3C转染GTPV AV 41株感染的BHK-21细胞,转染后18～24h就可见到特异性荧光。经EGFP筛选重组病毒,RT-PCR检测FMDV P1-2A-3C基因,抗原捕获ELISA检测FMDV抗原,结果表明,成功获得能稳定、正确表达目的蛋白的重组山羊痘病毒株TK+/EGFP+/ FMDV P1-2A-3C+/GTPV。本研究采用羊痘病毒弱毒株为基因工程活载体表达FMDV P1-2A-3C基因,为预防羊的烈性传染病口蹄疫和羊痘开创了新的思路。研究中构建的羊痘病毒活载体,将为反刍动物疾病基因工程活载体疫苗的研究提供技术、资源支持。