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弓形虫是一种呈世界性分布的寄生虫,人类、绵羊和禽等温血类动物几乎都会受到弓形虫感染,引起弓形虫病,是一种人兽共患性原虫。妊娠母体感染后可能引发流产、死胎、弱胎和畸胎等生殖障碍,成人感染会造成弓形虫眼病、淋巴结病、非化脓性脑炎和免疫抑制患者的死亡。由于我国绵羊和鸡弓形虫病的研究资料较少、且缺乏系统的分析,本研究针对我国河南、江苏、浙江及新疆地区的绵羊和河南省的鸡弓形虫的血清学调查及风险因素分析、虫株分离、基因型鉴定及其致病性进行研究,为我国畜禽弓形虫病的系统研究奠定基础。绵羊和鸡弓形虫的血清学调查及风险因素分析:2014年10月~2016年11月共采集913份家庭式饲养绵羊的血清,分别来自河南(356份)、江苏(247份)、浙江(208份)及新疆地区(102份);共采集河南地区700份散养鸡的血清。均采用改良凝集试验(MAT)对全部绵羊和散养鸡的血清进行弓形虫抗体检测,并对地域、性别、流产史和年龄进行相关性风险因素分析。结果发现:绵羊弓形虫抗体总体阳性率为19.06%(174/913),而各地域分别为河南23.31%(83/356)、江苏18.22%(45/247)、浙江21.15%(44/208)和新疆1.96%(2/102);河南散养鸡弓形虫抗体检出率为18.86%(132/700)。风险因素分析显示地域及流产史与绵羊感染弓形虫显著相关(P<0.05),年龄和性别与绵羊弓形虫病无显著相关性(P>0.05);散养鸡感染弓形虫与性别因素存在显著相关性(P<0.05),与年龄因素无相关关系(P>0.05)。绵羊和鸡弓形虫虫株的分离及基因型鉴定:取MAT阳性(滴度≥100)绵羊心肌36份(36/377)和散养鸡心肌25份(25/308),经酸性胃蛋白酶消化后背部皮下接种小鼠从而获得绵羊弓形虫分离株。用CV-1细胞接种绵羊弓形虫分离株包囊,培养得到弓形虫分离株速殖子,提取速殖子DNA,分别采用10个酶切位点(SAG1,SAG2,SAG3,BTUB,GRA6,c22-8,c29-2,L358,PK1和Apico)的限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)鉴别分离株的基因型。结果为:共获得2个绵羊弓形虫分离株,分别命名为TgSheepHn1和TgSheepHn2,最终鉴别两个虫株的基因型均为ToxoDB#9(Chinese1)。这是首次报道从绵羊体内分离获得的活体ToxoDB#9型弓形虫分离株。未从散养鸡心肌分离得到弓形虫虫株。绵羊弓形虫分离株的致病性:采用CV-1细胞培养获得的速殖子,血球计数板计数后,选择<1,10~0,10~1,10~2,10~3和10~4浓度的速殖子腹腔注射接种昆明小鼠。每天观察记录接种后小鼠的临床症状和死亡情况,为期60天。死亡的小鼠进行常规剖检,摘取和固定全部组织器官,制作常规石蜡切片并进行苏木素-伊红染色(HE)和免疫组织化学染色(IHC)。统计分析小鼠大脑弓形虫包囊负载量、CV-1细胞培养速殖子的生长时间及速殖子接种后小鼠的感染率、死亡率和存活时间进而评估绵羊分离株的毒力特征。对HE染色后的各组织切片进行病理损伤分析,分析IHC染色后的切片确定急性死亡期小鼠体内弓形虫抗原的分布。结果:TgSheepHn1和TgSheepHn2速殖子对小鼠的毒力均较强,且前者强于后者。二者1个速殖子浓度即可感染小鼠,最低100%致死浓度分别为100和1000个,急性感染期平均存活时间分别为10.5d和22d,但是有部分小鼠可耐过急性期感染进入慢性感染阶段而存活。急性期死亡(8DPI)小鼠病理损伤主要表现在小鼠的肺脏和小肠,其余脏器损伤轻微或未见明显异常,以充血及轻度炎症反应为主,具体表现为实质免疫器官淋巴细胞的局灶性坏死和网状细胞的增生。肺脏肺泡间质增宽、血管周围炎及水肿;小肠肠隐窝萎缩数量较少,粘膜上皮脱落,粘膜固有层增厚,粘膜下层水肿,肌层坏死排列疏松。急性期死亡小鼠(8DPI)体内弓形虫速殖子及其分泌抗原分布脏器较多,其中肾上腺、脾脏边缘部、肠系膜淋巴结、小肠整个肠段和部分生殖器官分布密度最高,推测小肠为两个虫株的重要入侵门户,可能该分离株对肾上腺和生殖系统具有较明显的侵袭能力。其余组织如肺脏、肝脏、肾脏、心肌和大脑也可观察到弓形虫抗原分布。