【摘 要】
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甜菜M14品系是利用二倍体栽培甜菜(Beta vulgaris L.)与四倍体野生白花甜菜杂交及回交获得的甜菜单体附加系。相关研究已经证实,甜菜M14品系具有野生白花甜菜抗旱、抗寒、耐盐、无融合生殖等优良性状。实验室前期对盐胁迫下甜菜M14品系进行了比较蛋白质组学分析,获得了76个差异蛋白质,其中乙二醛酶I受盐胁迫上调表达。进一步利用电子克隆及RACE技术获得了甜菜M14品系乙二醛酶Ⅰ基因(BvM
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甜菜M14品系是利用二倍体栽培甜菜(Beta vulgaris L.)与四倍体野生白花甜菜杂交及回交获得的甜菜单体附加系。相关研究已经证实,甜菜M14品系具有野生白花甜菜抗旱、抗寒、耐盐、无融合生殖等优良性状。实验室前期对盐胁迫下甜菜M14品系进行了比较蛋白质组学分析,获得了76个差异蛋白质,其中乙二醛酶I受盐胁迫上调表达。进一步利用电子克隆及RACE技术获得了甜菜M14品系乙二醛酶Ⅰ基因(BvM14-glyoxalase I)cDNA全长并进行了基因功能研究。结果表明,过量表达BvM14-glyoxalase Ⅰ基因能够提高烟草对盐胁迫的抗性。为了亲近的从转录调节水平了解该基因滴抗盐机制,这研究对甜菜M14品系BvM14-glyoxalase Ⅰ基因启动子功能进行了分析并对与其结合的转录因子进行了分离和分析。(1)利用Plant CARE软件,对实验室前期获得的BvM14-glyoxalase Ⅰ基因上游1830 bp启动子序列(P0)进行功能元件分析,发觉这启动子中涵盖TATAbox、CAAT等基本组成构件;同时含有与胚乳形成相关的元件:GCN4_motif、Skn-1 motif;与光反应相关的调控元件:ACE、Box-4、GAG-motif;与胁迫信号相关的元件:TC-rich repeats、MBS;响应激素的元件:CGTCA-motif等。(2)为了确定BvM14-glyoxalase Ⅰ基因启动子响应盐胁迫的核心区域,根据启动子中TATA-box及响应胁迫元件的位置进行5’端缺失,并通过设计引物进行扩增,获得P1(1483 bp),P2(1063 bp),P3(809 bp),P4(714 bp),P5(567 bp)启动子缺失片段。为了初步检测BvM14-glyoxalase Ⅰ基因各启动子缺失片段滴活性,创建了BvM14-glyoxalase Ⅰ基因启动子不同长度片段滴植物表述载体,利用烟草瞬时表达,对该基因启动子各缺失片段的启动活性及响应盐胁迫能力进行了快速鉴定;为了亲近滴对烟草瞬时表达的实验结果进行验证,又利用拟南芥对带有各启动子片段的植物表达载体进行稳定表达,检查盐钳制前后拟南芥阳性植被滴GUS酶活及GUS染色结果。经过瞬时表述及稳定表述结果分析,确定P4片断为该基因启动子响应盐钳制滴最强启动子片段。(3)构建甜菜M14品系0 mM、200 mM NaCl处理的cDNA文库,以BvM14-glyoxalase Ⅰ基因启动子核心序列P4片段为诱饵,通过酵母单杂交实验,筛选0mM、200 mM NaCl处理的cDNA文库,获得阳性克隆并进行测序。在200 mM NaCl处理下,获得调控BvM14-glyoxalase Ⅰ基因的7个特有转录因子基因cDNA序列。(4)使200 mM NaCl处理下,7个特有转录因子基因cDNA行列举办生物信息学分析,分别进行了读码框分析、同源序列分析、进化树分析、热图分析、共表达分析。(5)将7个转录因子序列与拟南芥数据库进行比对找到同源基因的蛋白序列,利用在线预测蛋白互作string网站,得到与这7个转录因子和BvM14-glyoxalase I互作蛋白的分子网络。
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