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目的:通过体内外实验探讨八宝丹(Babao Dan;BBD)对胃癌生长的影响,从细胞增殖、细胞凋亡和细胞自噬三方面探究BBD抗胃癌的作用机制,为传统中药BBD抗胃癌临床治疗提供理论依据。方法:1.体外实验:(1)体外培养胃癌细胞(AGS和MGC80-3),经不同浓度的BBD(0、0.25、0.5、1 mg/mL)干预细胞24 h后,显微镜下观察细胞形态的改变;台盼蓝计数分析细胞数的改变;采用LDH法检测细胞毒性作用;集落形成实验、周期实验分别检测细胞集落形成能力和细胞周期的影响;Western blot检测PCNA、Survivin、Cyclin D1、CDK4、p21增殖蛋白表达;(2)Hoechst 33258染色、Annexin V-APC染色检测细胞凋亡;JC-1染色测定线粒体膜电位的变化;Western blot检测Bax、Bcl-2、Fas、FasL凋亡相关蛋白表达水平;比色法分析caspase-3/-8/-9的活化情况;(3)Western blot检测LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ转换及p62、Beclin-1自噬蛋白水平;(4)Bio-plex检测MAPK(p-JNK1/2/3、p-p38、p-ERK1/2)活化情况和Western blot检测PI3K、p-AKT、p-mTOR、p-AMPKα蛋白的表达。2.体内实验:建立MGC80-3皮下移植瘤模型,按照瘤体体积随机分成两组:对照组(Control组)和BBD组(0.25 g/kg);一个月后取材。(1)取材当天对剥离的瘤体进行称重并拍照分析BBD对瘤重和对移植瘤大小的影响;(2)TUNEL检测瘤组织细胞凋亡情况;(3)IHC检测Ki-67蛋白表达和Western blot检测PCNA、Survivin、Cyclin D1、CDK4、p21、Bax、Bcl-2、cleaved-caspase-3、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ转换、p62、Beclin-1蛋白表达;(4)Bio-plex和Western blot检测瘤组织中p-JNK1/2/3、p-p38、p-ERK1/2、PI3K、AKT、p-AKT、mTOR、p-mTOR、AMPKα、p-AMPKα蛋白表达情况。结果:1.体外实验:(1)BBD抑制细胞数量及生长密度;LDH实验显示BBD显著增加细胞毒性(P<0.01);集落形成实验和周期实验表明BBD抑制细胞增殖(P<0.05);Western blot实验表明BBD上调p21而下调PCNA、Survivin、Cyclin D1、CDK4蛋白表达抑制细胞增殖(P<0.05);(2)Hoechst 33258和Annexin V-APC染色表明BBD促进细胞凋亡(P<0.01);JC-1染色也表明BBD导致MMPs逐渐下降(P<0.01);Western blot实验显示BBD上调Bax、Fas、FasL而下调Bcl-2凋亡蛋白表达(P<0.05);比色法结果表明BBD可促进caspase-3/-8/-9活化(P<0.05);(3)Western blot结果显示BBD增加LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ转换及Beclin-1的表达而下调p62的表达(P<0.05);(4)Bio-plex结果显示BBD抑制细胞中MAPK(p-JNK1/2/3、p-p38、p-ERK1/)活化(P<0.05);Western blot结果显示细胞中PI3K蛋白表达水平降低,p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR比值降低,p-AMPKα/AMPKα比值升高(P<0.05)。2.体内实验:(1)BBD减少胃癌细胞移植瘤小鼠体内的瘤重(P<0.05),但对治疗前后的小鼠体重无明显影响(P>0.05);(2)TUNEL结果显示BBD诱导瘤组织细胞凋亡(P<0.01);(3)IHC检测结果显示BBD降低瘤组织中Ki-67蛋白表达(P<0.01);Western blot结果显示BBD促进瘤组织中Bax、cleaved-caspae-3、p21、LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ转换、Beclin-1蛋白表达,降低Bcl-2、PCNA、Survivin、Cyclin D1、CDK4、p62蛋白表达(P<0.05);(4)Bio-plex和Western blot实验表明了BBD抑制瘤组织中p-JNK1/2/3、p-p38、p-ERK1/蛋白表达;Western blot结果显示BBD降低瘤组织中PI3K蛋白表达、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR的比值,并增加p-AMPKα/AMPKα的比值(P<0.05)。结论:BBD在体内外对胃癌均具有显著的抑制作用,能够抑制胃癌细胞增殖,诱导胃癌细胞凋亡及自噬。BBD通过抑制MAPK(p-JNK1/2/3、p-ERK1/2、p-p38)和PI3K/AKT的活化及促进AMPK的活化进而抑制mTOR信号通路的活化发挥对胃癌的抑制作用。