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目的肥胖使机体处于一种慢性低度炎症状态,引发巨噬细胞的聚集和M1样极化。这种现象不仅发生在内脏脂肪诱发严重胰岛素抵抗,也发生在胰岛内部。聚集的M1型巨噬细胞释放的前炎症因子会导致胰岛β细胞的去分化,功能性β细胞的数量减少,从而加剧2型糖尿病（T2D）的发生。前期研究发现胡椒碱对成年MSG糖尿病小鼠严重的代谢性炎症、糖脂代谢紊乱以及胰岛素抵抗具有良好的调控作用。因此本课题旨在研究胡椒碱是否通过抑制饮食诱导的C57肥胖小鼠内脏脂肪及胰岛内巨噬细胞的聚集和M1样极化,保护胰岛β细胞功能,从而延缓肥胖致T2D的发生。方法1.动物实验。50只7周龄雄性C57BL/6C小鼠,体重20～22 g,适应性喂养1周后,按照体重和空腹血糖（FBG）水平进行分组:正常饮食组、高脂饮食（HFD）组、罗格列酮组（4 mg/kg/day）、胡椒碱低剂量组（15 mg/kg/day）和胡椒碱高剂量组（30 mg/kg/day）,灌胃给药,每天一次,连续8周。期间密切观察动物一般情况,每周检测小鼠的体重和摄食量。通过FBG、口服糖耐量（OGTT）、血清胰岛素水平和胰岛素耐量（ITT）评价胡椒碱对HFD肥胖小鼠糖代谢紊乱的改善作用。8周时进行高葡萄糖钳夹实验,测定稳态葡萄糖输注速率（GIR）以及稳态时血清胰岛素水平,整体水平评价胡椒碱对HFD肥胖小鼠胰岛功能的保护作用。实验结束时收集血清,附睾脂肪和胰腺等组织。测定血清胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平。采用Elisa方法检测血清相关致炎因子IL-1β、Gal-3和LPS水平以评价胡椒碱对HFD肥胖小鼠代谢性炎症的改善作用。qPCR实验进一步检测附睾脂肪组织中IL-1β、Gal-3的mRNA水平。附睾脂肪和胰岛分别进行HE和Gomori染色进行病理学分析,并用免疫组化方法检测组织内CD11c阳性M1样巨噬细胞极化标志物和前炎症因子的表达。为了评价胡椒碱对HFD小鼠胰岛β细胞功能和去分化的影响,采用免疫荧光检测胰岛内胰岛素和胰高血糖素的表达及定位,检测β细胞功能成熟标志物Pdx1和前体标志物ALDH1A3的表达。最后采用免疫组化检测胰岛内mTOR、4E-BP1和PS6的表达探究胡椒碱保护β细胞功能的作用机制。2.细胞实验。为了证实胡椒碱通过抑制巨噬细胞M1样极化以延缓Min6细胞去分化、提高其合成胰岛素的能力。首先,胡椒碱（20、40、80μM）预处理RAW264.7巨噬细胞细胞12 h,然后加入LPS（1μg/m L）孵育24 h,刺激RAW264.7细胞发生M1样极化,采用qPCR实验检测细胞中CD11c的mRNA水平,Elisa方法测定上清液中炎症因子Gal-3和IL-1β的含量以明确胡椒碱对RAW264.7细胞M1样极化的影响。利用上述细胞上清液制备条件培养基用于处理Min6细胞（24 h）,采用免疫荧光标记检测Min6细胞中胰岛素、Pdx1和ALDH1A3的表达。然后通过WB实验分析mTOR、4E-BP1和PS6的蛋白表达水平。结果1.动物实验。胡椒碱在不影响小鼠摄食量的情况下有效防止HFD肥胖小鼠体重的快速增加。胡椒碱显著降低血清FBG、TC、TG和LDL水平,明显改善HFD肥胖小鼠糖脂代谢紊乱。OGTT和ITT结果显示胡椒碱能够改善HFD小鼠口服葡萄糖不耐受和胰岛素抵抗,增强外周组织对胰岛素的敏感性,使HFD肥胖小鼠的高胰岛素血症得到显著减轻。胡椒碱能够降低血清中LPS、IL-1β和Gal-3等致炎因子的水平。qPCR结果显示,胡椒碱减少附睾脂肪内多个炎症因子的mRNA水平,尤其抑制M1样巨噬细胞标志物CD11c的表达,证实胡椒碱强大的免疫炎症调控作用。免疫组化结果进一步证实胡椒碱还抑制了胰岛内M1样巨噬细胞炎症因子的高表达。胰岛功能评价的金标准“高葡萄糖钳夹实验”结果提示胡椒碱提高了HFD肥胖小鼠稳态时的葡萄糖输注速率,并降低稳态时血清胰岛素含量,胰岛功能得到很好的保护。随后的免疫荧光实验结果显示胡椒碱提高胰岛内由β细胞分泌的胰岛素含量,降低了α细胞分泌的胰高血糖素含量。同时还促进β细胞功能成熟标志物Pdx1的高表达,降低去分化前体细胞标志物ALDH1A3的表达。免疫组化结果显示胡椒碱延缓β细胞去分化的作用与mTOR/4E-BP1/PS6的活性成正相关。2.细胞实验。qPCR结果显示,胡椒碱明显降低LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞CD11c的mRNA水平,胡椒碱对LPS诱导的巨噬细胞M1样极化具有一定抑制作用。Elisa结果表明,胡椒碱显著降低RAW264.7细胞上清液中前炎症因子（IL-1β、Gal-3）的含量,并与胡椒碱浓度呈正相关。免疫荧光实验显示,胡椒碱条件培养基明显增强Min6细胞中成熟分化标志物Pdx1表达,并降低前体标志物ALDH1A3的表达。最后,WB结果进一步证实了胡椒碱对Min6细胞功能的保护作用与mTOR/4E-BP1/PS6的表达有关。结论胡椒碱能够有效抑制HFD肥胖小鼠脂肪和胰岛内巨噬细胞的聚集和M1样极化,减轻全身代谢性炎症和胰岛内巨噬细胞的炎性浸润,有效防止HFD肥胖小鼠胰岛功能的下降及胰岛β细胞的去分化,而且此过程与mTOR/4E-BP1/PS6通路的活化密不可分。