柠檬酸合成酶、顺乌头酸酶对柠檬酸循环强度影响较大,因此克隆两酶的基因,导入产富马酸菌StrainABCDIA,使富马酸产量在前人基础上进一步提高;然后,为了探究胞内NAD+/NADH 比值对富马酸积累的影响,在产富马酸菌StrainABCDIA内分别导入异源NADH氧化酶基因及自源转氢酶基因,富马酸单位质量产量为0.54 g/g菌体和0.67 g/g菌体,虽然生物量不及StrainABCDIA,但菌体自身的产酸能力得到增强,说明辅因子的调节有利于富马酸的积累。后对之前的研究进行整合优化,得到EcS、EcN、CgS、CgN四株菌。以改良的M9培养基进行重组菌的摇瓶发酵,在生物量和富马酸产量上,四株菌都比对照菌StrainABCDIA高,但是整体相差不大。其中CgS富马酸产量较高,达到0.511 g/L。但由于生长情况较差,这个产量没有达到预期。但对比菌体单位质量产量,CgS富马酸产量可以达到0.937 g/g菌体,与对照菌株StrainABCDIA单位产量相比提高20%,与其他菌株相比优势较为明显。从细胞内的辅因子NAD+/NADH来看,CgS比StrainABCDIA提高了40.24%,说明虽然多基因的表达加重了菌体生长负担,但对柠檬酸循环和辅因子的调节确实增强了菌体的产富马酸能力。对生物法产富马酸酯进行探索,异源表达对富马酸特异性的酰基连接酶和酰基转移酶。用ELLMAN法对测定BafX蛋白酶活,根据体系中辅酶A的减少量进行计算,测得酶活力较低,但整体呈现为具有活力的趋势,接着用同样的方法对BafX的最适反应条件进行探究,得到的结果是在反应温度为25℃,pH为8.0,ATP浓度为0.2 mmol/L时,酶促反应速率最优。