长久以来,肿瘤一直是威胁人类生命的最常见疾病之一,放疗是临床上治疗肿瘤（尤其是恶性肿瘤）的主要手段。全世界每年约有700万肿瘤患者接受放射治疗。虽然放射治疗技术的发展提高了放射治疗设备的照射精度和靶向性,但仍难以避免对周围组织产生影响从而降低患者的生活质量。骨组织是放射治疗中最常见的损伤部位之一。放射可导致骨量的持续丢失和骨力学质量的恶化,增加骨质疏松性骨折和骨坏死的风险。随着肿瘤诊疗技术的不断发展,肿瘤的治愈率明显提高,患者的生存期明显延长（如前列腺癌10年生存率接近90%）,这也使得放射性骨损伤（放射治疗的一个重要的长期并发症）,越来越引起科学家和临床工作者的关注。然而,放射性骨损伤的机制尚未明确,目前还缺乏有效、安全的预防和治疗放射性骨损伤的方法。脉冲电磁场（PEMF）在维持骨组织和骨细胞生理功能中起着重要作用,外源性PEMF刺激能够显著加速骨折愈合。PEMF凭借其安全、无创、简便等独特优势,成为治疗临床骨科疾病（骨质疏松、骨折愈合等）的重要手段。课题组前期研究发现PEMF刺激可以修复1型糖尿病的骨损伤。但是PEMF刺激是否能修复放射引起的骨损伤,以及其对抗放射骨损伤的信号通路和传导机制尚不明确。本研究首先通过构建局部放射骨损伤动物模型（总放射剂量为8 Gy,1.6 Gy/min,照射5 min）,进行体内实验探究PEMF刺激对放射骨损伤动物的骨合成代谢和骨损伤修复作用。然后,通过体外实验探究PEMF刺激对放射损伤后成骨细胞（OB）的增殖能力、凋亡水平、分化能力、矿化能力以及成骨相关的基因和蛋白表达水平的影响,系统地研究了PEMF刺激对放射损伤后骨细胞（OCY）、破骨细胞（OC）及肿瘤细胞（MCF7、SW620、A375、143B）活性和功能影响。最后,通过基因沉默技术明确PEMF刺激修复放射损伤后OB的行为功能的分子机制。本研究提出了PEMF刺激通过促进骨合成代谢和骨损伤修复对抗放射骨损伤,探究了放射性骨损伤和PEMF刺激对抗放射骨损伤的潜在机制。本研究为PEMF刺激在未来广泛用于治疗放射骨损伤患者、提高放射治疗的肿瘤患者的生活质量提供了关键的科学依据,具有重要的临床研究和科学实验价值。整个研究主要分为以下四个部分:第一部分:PEMF对抗放射线诱发骨质流失的动物实验研究背景:肿瘤患者在放射治疗的同时会增加骨质疏松性骨折的发生风险,也可能导致骨坏死的发生。因此,探索以促骨形成为基础的安全有效且靶向性强的放射骨损伤医学干预手段具有重要的临床价值。低强度PEMF治疗能防治骨质疏松、治疗骨不连和骨折延迟愈合,提示PEMF在维持骨组织和细胞生理功能中发挥关键作用。但是,PEMF刺激是否能够对抗放射治疗造成的骨损伤目前国内外尚未见文献报道。方法:通过放疗设备对大鼠的右后肢施加局部放射以构建大鼠放射骨缺损模型,PEMF组大鼠连续施加45天全身PEMF刺激。使用Micro-CT、H＆E染色、免疫荧光染色、钙黄绿素荧光双标、免疫组化、TUNEL染色、扫描电镜、TRAP染色、血清ELISA实验、纳米压痕测试等方法分析各组大鼠股骨的骨量、骨微结构、骨组织形态学、骨合成代谢及OB、OC和OCY的活性。结果:放射损伤后大鼠的小梁骨数量、骨微结构和材料属性被显著破坏,血清中OCN和P1NP的表达显著降低,血清CTX-1和TRACP-5b显著升高,股骨OB中γ-H2AX表达升高、Cbfα1的表达降低且OB数量显著降低,OC活性升高,OCY形态被显著破坏。PEMF刺激显著降低了γ-H2AX的表达,改善了放射损伤后大鼠的小梁骨数量、骨微结构和材料属性。PEMF刺激促进了放射损伤后大鼠股骨OB中的Cbfα1表达,抑制了OB凋亡,且大鼠血清中OCN和P1NP的表达显著上升,但PEMF刺激对放射损伤后大鼠股骨的OC活性、OCY形态以及血清中CTX-1和TRACP-5b表达均没有显著作用。结论:放射损伤通过抑制骨形成和促进骨吸收来破坏骨微结构和材料属性进而造成骨损伤,PEMF刺激通过抑制DNA双链断裂（DSB）促进放射损伤大鼠的OB成骨功能、抑制OB凋亡来促进骨形成从而改善骨微结构和材料属性,对抗放射骨损伤。本研究有望为PEMF刺激应用于放射损伤引起的骨质减少和骨损伤的临床治疗提供一定的实验参考。第二部分:PEMF对于放射线作用下体外骨组织细胞功能活性的调控效应研究背景:当骨吸收与骨形成处于动态平衡时,骨骼能维持其结构和功能的完整性,当骨稳态环境被破坏时,骨微结构受到显著影响。第一部分体内实验结果表明PEMF刺激通过显著提升骨形成速率对抗放射骨损伤,但PEMF刺激对于骨吸收的抑制效应并不显著。PEMF是否通过激活OB对抗放射所致骨损伤的发生发展,尚无研究报道。方法:对细胞进行放射损伤以构建体外放射损伤模型,并使用PEMF发生器对细胞损伤模型施加PEMF刺激。通过组织块法提取OB,使用免疫荧光染色、ALP染色、ALP活性分析、茜素红S染色、qRT-PCR、Western Blotting等方法分析各组OB中γ-H2AX表达、分化、矿化和成骨相关因子的表达能力,通过qRT-PCR实验分析各组OCY细胞因子表达水平,并使用TRAP染色分析OC的活性。结果:体外实验结果表明,放射显著增加了γ-H2AX表达,抑制了OB分化、矿化能力及成骨相关基因和蛋白的表达,同时显著增加了OC活性,且对OCY的细胞因子分泌没有显著影响。施加PEMF刺激后,放射损伤的OB中γ-H2AX的表达降低,成骨分化、矿化能力及成骨相关基因和蛋白的表达显著升高,但OC活性和OCY的细胞因子分泌水平没有变化。结论:PEMF刺激能够特异性抑制放射骨损伤后OB中DSB从而提高分化能力和矿化能力,促进OB中骨形成相关的基因与蛋白的表达,但PEMF刺激对放射骨损伤后OCY和OC活性没有显著影响,说明了OB对PEMF具有高度敏感。本部分研究揭示了PEMF通过特异性干预OB对抗放射骨损伤,丰富了关于PEMF对抗放射骨损伤的认识,并提示PEMF作为一种安全、无创、易获得和低成本的方法,除了用于防治航天飞行中发生的骨丢失之外,还可能成为对抗临床放射治疗导致的骨骼质量受损和骨折风险升高的有效方法。第三部分:初级纤毛在成骨细胞和肿瘤细胞间的差异性表达介导了PEMF特异性对抗放射骨损伤的实验研究背景:初级纤毛是OB表面的感觉细胞器,能够感知和转导外部机械刺激和电磁刺激从而调控细胞内的信号转导。并且初级纤毛在OB中特异性表达,在许多肿瘤细胞中是缺乏表达的。前一部分的结果证明PEMF作为物理因子通过特异性激活放射损伤骨中OB促进骨形成以对抗放射骨损伤,但OB是否是通过成骨细胞和肿瘤细胞间初级纤毛的差异性表达感知外界PEMF刺激对抗放射骨损伤还需进一步研究。方法:对细胞进行放射损伤以构建体外放射损伤模型,并使用PEMF发生器对细胞损伤模型施加PEMF刺激。通过组织块法提取OB,使用免疫荧光检测OB和肿瘤细胞中初级纤毛的表达,并通过MTT和流式细胞术分析各组OB、肿瘤细胞（MCF7、SW620、A375、143B）的增殖和凋亡水平。使用shRNA抑制初级纤毛的表达,而后通过ALP染色、ALP活性分析、茜素红S染色、qRT-PCR、Western Blotting等方法分析各组OB的分化、矿化能力和成骨相关因子的表达能力。结果:实验结果显示,OB中特异性表达初级纤毛时,肿瘤细胞中无显著的初级纤毛表达。此外,放射显著抑制了OB和肿瘤细胞的活性,显著促进OB和肿瘤细胞的凋亡。施加PEMF刺激后,OB活性增加、凋亡减少,但PEMF刺激对肿瘤细胞没有显著作用。PEMF刺激也显著促进了放射损伤后OB的增殖能力,抑制了OB的凋亡水平,增加了OB的分化、矿化能力及成骨相关基因和蛋白的表达,但沉默初级纤毛基因后,PEMF刺激对OB的增殖能力、增殖能力、分化、矿化能力及成骨相关基因和蛋白的表达没有显著作用。结论:PEMF刺激通过OB和肿瘤细胞间初级纤毛的差异性表达从而特异性调控OB的功能活性进而对抗放射骨损伤。本部分研究丰富了初级纤毛在PEMF对抗放射骨损伤中重要作用的认识,为探究PEMF刺激对抗放射骨损伤的相关机制奠定了基础,并且为未来PEMF刺激广泛用于临床治疗放射骨损伤患者提供了关键的科学依据。第四部分:PEMF通过成骨细胞“初级纤毛-NF-κB-Ku70”信号级联特异性对抗放射骨损伤的实验研究背景:前三部分研究已经证实PEMF刺激是通过抑制DSB,调控OB活性对抗放射骨损伤,且OB是通过其特异性表达的初级纤毛感知外界PEMF刺激对抗放射骨损伤的。然而,OB是如何通过初级纤毛感知外界PEMF刺激诱导DSB修复的信号级联调控机制,尚未被系统阐明。Ku70是DSB修复过程中的主要修复蛋白,应激状态（如放射损伤）会增加Ku70的表达。此外也有研究发现Ku70的表达受到NF-κB的调控。因此,我们猜想PEMF通过刺激OB中的初级纤毛,激活NF-κB入核调控Ku70修复DNA损伤进而对抗放射骨损伤。方法:使用免疫荧光技术分析PEMF刺激对放射骨损伤OB中Ku70的表达的影响。抑制OB中Ku70后,使用MTT、流式细胞术、ALP染色、ALP活性实验、茜素红S染色、qRT-PCR、Western Blotting等方法分析各组OB的凋亡、分化、矿化能力的变化,以及成骨相关基因和蛋白的表达水平。通过免疫荧光技术、Western Blotting分析IFT88基因抑制后各组OB的NF-κB、Ku70的表达。而后,使用Western Blotting分析NF-κB阻断后,各组OB中Ku70的表达水平。结果:首先明确了PEMF刺激激活了放射损伤后OB中Ku70。当Ku70被阻断时,与未抑制组相比,PEMF刺激放射损伤后OB成骨分化、成骨矿化能力及成骨相关蛋白表达的促进作用也被显著抑制。阻断初级纤毛后,OB中NF-κB入核表达也被明显抑制。NF-κB被阻断后,PEMF刺激显著抑制了放射损伤后OB中Ku70表达。结论:该部分研究发现PEMF刺激通过初级纤毛信号级联网络（初级纤毛-NF-κBKu70）调控放射损伤后OB功能活性对抗放射骨损伤。本研究能进一步丰富学者们对于放射性骨损伤以及骨骼电磁信号转导机制的认识,为PEMF刺激在未来广泛用于治疗放射骨损伤患者、提高放射治疗的肿瘤患者的生活质量提供了关键的科学依据,具有重要的临床治疗和科学研究价值。