研究背景目前,脂肪组织工程技术理论的发展,为真正实现无损伤修复软组织缺损和真正意义上的形态、结构与功能重建开辟了新的途径。但仍有很多因素制约着脂肪组织工程技术的发展。其中没有合适的细胞支架材料及生物学活性的细胞因子是制约其发展的重要因素。合适的生物支架材料是组织工程学中一个非常重要的组成部分,它不仅是细胞和生物活性因子进入机体的载体,而且还可以支持细胞在体内的增殖和分化及分泌活性细胞因子。理想的脂肪组织工程支架应具有：①适于细胞粘附、增殖和分化的三维空间结构；②具有良好的机械力学性能,不仅与宿主软组织特性相匹配,还要能够抵抗软组织的压力支持种子细胞的生长发育；③具备良好组成成分,对组织无毒、无副作用、无免疫原性；④具有特殊的生物刺激作用,如促进细胞的增殖分化,促进血管生成,促进宿主干细胞的迁移和分化等。但是,虽然目前对于支架材料的应用研究很多,但每种支架材料都有自身的局限性,所以至今仍无适合于脂肪组织工程的理想支架材料。关于脂肪组织工程支架材料的选用还在不断摸索当中。细胞外基质(Extracellular Matrix,ECM)是存在于细胞表面或细胞之间的大分子,主要是一些多糖和蛋白或蛋白聚糖。ECM中含有大量的细胞活性成分,从而对细胞的粘附、增殖、迁移、分化和基因表达的调控发挥着重要的调节作用。脂肪组织当中不仅含有大量的细胞成分,而且还含有丰富的ECM成分,包括胶原、网状纤维、弹性纤维、神经纤维、血管基质和淋巴结。从脂肪组织当中提取细胞外基质并构建成支架理论上完全具有可行性,国内还未见相关报道。碱性成纤维细胞生长因子(Basic fibroblast growth factor, bFGF)因具有明显促进脂肪来源干细胞(Adipose-derived stem cells, ADSCs)和骨髓基质干细胞的血管化、迁移和成脂分化的作用,在脂肪组织工程研究领域是一种比较理想的细胞因子。但是,bFGF在体内应用时扩散快、对热和酸非常敏感、易被蛋白酶分解、半衰期仅为3～5min,严重限制了其生物学效应的发挥。药剂学的缓释技术很好的解决这一难题,它通过微球包埋技术将bFGF包埋于聚乳酸纳米微球中,从而使这种细胞因子能够缓慢的释放,达到对周围环境持续发挥生物学效应的目的。这种缓释技术在脂肪组织工程的研究领域具有很大的研究价值。研究目的1.从人脂肪组织当中分离提取ADSCs,并进行多向诱导分化,探讨其干细胞特性及作为脂肪组织工程理想种子细胞的优势；2.体外构建bFGF聚乳酸纳米微球缓释系统(bFGF-PLA-NS),检测体外缓释能力；并检测这种缓释微球体外对ADSCs增殖和成脂分化能力的影响,探讨其应用于脂肪组织工程研究的可行性；3.体外收集人脂肪组织,并分离提取细胞外基质,将其制备成粉末状,分析其结构特点,探讨其作为脂肪组织工程支架材料的可行性；4.体外DiI荧光标记ADSCs并将ADSCs与细胞外基质支架进行粘附,分析ADSCs与细胞外基质支架的生物相容性,探究这种细胞外基质支架材料能否应用于体内研究实验；5.通过设计合理对照,将细胞外基质支架联合bFGF-PLA缓释微球及ADSCs移植于裸鼠体内,探讨细胞外基质支架联合bFGF-PLA缓释微球对ADSCs构建工程化脂肪组织的影响。材料与方法1. ADSCs的体外分离培养及多向诱导分化鉴定收集抽脂术患者的脂肪组织,纯化后用Ⅰ型胶原酶消化、过滤、离心、铺皿进行原代培养,观察细胞生长状态。第3代的ADSCs用于实验研究。用MTT法绘制细胞增殖生长曲线；用相应的定向诱导液对ADSCs向脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞方向诱导分化,并用油红O、茜素红和阿新蓝染色进行鉴定。2.体外构建bFGF-PLA缓释微球并检测其对ADSCs增殖和成脂分化能力影响体外用超声乳化法构建bFGF-PLA缓释微球,检测微球载药量和包封率；透射电镜观察微球包被情况并测量直径；用ELISA试剂盒检测bFGF-PLA缓释能力,连续检测21d；体外将不同浓度的bFGF-PLA缓释微球加入ADSCs培养液及成脂诱导液中,用MTT法和油红O定量检测法检测其对ADSCs增殖和成脂分化的影响,分析缓释微球最佳的作用浓度,为下一步实验提供依据；3.体外构建人脂肪组织细胞外基质支架收集接受抽脂术患者的脂肪组织,经过纯化、匀浆、离心、洗涤等处理分离提取人脂肪组织细胞外基质并经、冻干、粉碎处理将其制备成粉末状。大体观察及扫描电镜观察其结构特性,分析其作为脂肪组织支架材料的可行性;4.人ADSCs与细胞外基质支架体外生物相容性的研究体外将ADSCs用EGFP或者DiI荧光标记,检测标记后细胞的增殖和成脂分化能力；将标记的ADSCs与细胞外基质支架粘附,检测粘附率并荧光显微镜及扫描电镜观察细胞在支架表面粘附生长情况,用MTT法检测细胞与支架粘附后生长增殖情况,并绘制生长曲线,与正常的ADSCs生长曲线相比较；5.人细胞外基质支架联合bFGF-PLA缓释微球对ADSCs体内构建脂肪组织的影响研究将ADSCs与人细胞外基质支架及bFGF-PLA形成复合物,进行体内移植实验；分为三组：1组为人细胞外基质支架+细胞培养液,共0.5ml；2组为人细胞外基质支架+ADSCs混悬液,共0.5ml,含有1×107细胞量；3组为人细胞外基质支架+ADSCs+bFGF-PLA混悬液,共0.5ml,含有1×107细胞量和4mg/ml的bFGF-PLA。将以上三组混合物分别注射移植于裸鼠背部皮下,每只移植三个点。8w后取出新生物,进行新生物大体观察和湿重测量后,分别行冰冻切片荧光显微镜观察、冰冻切片行油红O染色定性检测及常规HE染色进行组织学检测；高倍镜下计数三组新生血管密度并行统计分析比较。统计学处理(二级标题)所得数据均采用SPSS13.0软件包进行统计分析,以均数±标准差(x±s)表示。P<0.05差异有统计学意义。结果1.从抽脂术患者得到的脂肪组织当中成功分离得到ADSCs,贴壁生长的ADSCs形态类似于成纤维细胞,具有很强的分裂增殖能力。用成脂、成骨、成软骨定向分化诱导液诱导2～3周后,分别用油红O、茜素红、阿新蓝染色呈阳性反应。2.体外成功构建bFGF-PLA缓释微球,微球表面光滑、球体大小均匀、形态饱满；微球直径平均为(28.98±0.50)nm；微球样品包封率为(89.54±1.45)%,计算样品的载药量为：{(17.91±0.29)×10-3}%；通过ELISA方法检测微球缓释特性,21d内微球可缓慢释放bFGF,第21d累计释药率为79.85%；bFGF-PLA缓释微球能够明显促进ADSCs的增殖和成脂分化的效率,最佳的作用浓度为4mg/ml。3.人脂肪组织当中提取出来的细胞外基质,经过冻干粉碎之后外观呈白色粉末状,颗粒体积均匀、疏松,其多孔状的结构特点有利于种子细胞与支架粘附和增殖分化。扫描电镜观察可见颗粒表面有较平坦的表面结构,表面积较大,这种结构特点适于细胞粘附伸展生长。4.ADSCs经Ad.EGFP或DiI荧光标记后,其增殖和成脂分化的能力并不会受到明显影响；DiI标记前后ADSCs与ECM支架的粘附率分别为：(88.81±4.81)%和(86.48±4.58)%,经统计学比较并无差异性；ADSCs与ECM支架粘附后其增殖能力不会受到影响。细胞粘附于支架表面后扫描电镜观察可见细胞呈扁平短梭形或三角形,在支架表面粘附生长状态良好。5.体内移植8w后6只裸鼠全部成活,三组均可形成瘤块,大体观察第1组、2组和3组体积呈递增趋势,第1组颜色苍白,第2组颜色淡黄,第3组黄色更接近正常脂肪组织的颜色,三组湿重平均分别为：(0.032±0.005)g；(0.041±0.006)g；(0.049±0.005)g,经统计学分析处理后,三组两两之间比较P值均小于0.05,2组较1组为重,第3组较前两组重；组织切片HE切片可见第3组形成了大量的成熟脂肪细胞,细胞聚集成巢状,第2组也可形成成熟的脂肪细胞,但明显比第3组少,生成的脂肪细胞巢也较少,第1组并无成熟脂肪细胞巢可见,只观察到少量单个或数个脂肪细胞分布在支架内部,油红O染色切片镜下观察情况同HE切片；荧光显微镜下观察可见第3组脂肪细胞聚集处有明显的红色荧光,第2组荧光较少,第1组并未见到红色荧光；1、2、3组新生血管平均数分别为：(3.00±1.28)个/HP,(3.28±1.36)个/HP,(4.44±1.15)个/HP。经随机设计资料样本均数间的多重比较P值分别为：1组和2组比较P=0.514>0.05；1组和3组比较P=0.001<0.01；2组和3组比较P=0.008<0.01；可见1组和2组之间血管密度并无统计学差异,而3组较前两组差异有显著性。结论1.抽脂术获得的脂肪组织能够成功分离提取大量的多能干细胞,经形态学、分子表面标记及多向分化鉴定证实为脂肪来源干细胞。该细胞容易获取、可稳定传代、在相应的诱导条件下能够分化成为目的细胞,可作为脂肪组织工程理想的种子细胞；2.将bFGF包被于PLA微球中,可以使微球中bFGF缓慢释放进入局部微环境,从而达到bFGF对周围细胞持续发挥作用的目的。bFGF-PLA缓释微球体外对ADSCs具有明显的促增殖作用,同时也能够明显促进ADSCs向脂肪细胞方向分化。3.人脂肪组织细胞当中可提取细胞外基质,提取的细胞外基质具有容易获取,形状和颗粒体积具有高度的多样性,表面积较大等优点,有利于脂肪干细胞的粘附和增殖,可有望成为一种较理想的脂肪组织工程支架材料。4.人ADSCs用Ad.EGFP和DiI荧光标记后并不会对细胞的增殖生长产生影响,两种标记方式都适合ADSCs的体内示踪的应用。ADSCs在体外与人脂肪组织ECM支架具有很好的生物相容性,粘附率较高,细胞增殖生长能力并不会受到影响。5.人脂肪组织细胞外基质支架联合bFGF-PLA与ADSCs体内能够成功构建出成熟的脂肪组织,细胞外基质支架和bFGF-PLA体内能够显著提高ADSCs成脂分化的效率和移植物血管化的水平,可作为一种理想的支架材料和微环境细胞因子应用于脂肪组织工程的研究。