论文部分内容阅读
舞毒蛾Lymantria dispar (Linnaeus),属鳞翅目(Lepidoptera)裳蛾科(Erebidae)毒蛾亚科(Lymantriinae),是一种广泛危害的食叶害虫,通常分为欧洲型舞毒蛾和亚洲型舞毒蛾。2009年北美植物保护组织(NAPPO)正式通过了第33号植物卫生措施区域标准,对来自亚洲型舞毒蛾疫区的30个(包括中国)被重点关注口岸的船舶及货物实施特别检疫措施,对我国的出口外贸带来极大的不便。然而我国对美贸易港口主要位于舞毒蛾低密度发生区,且这些地区都属于之前经常误报舞毒蛾的地区(因舞毒蛾与其近缘种外形非常相似),所以从总体上来说,输美船舶集装箱在我国港口感染舞毒蛾的几率应该排除掉之前误报导的舞毒蛾近缘种感染的几率。因此,研究亚洲型舞毒蛾及其近缘种的基因差异,解决快速种群鉴定问题已迫在眉睫,它是解决美国对中国实施贸易壁垒的关键因素。鉴于此,本研究以亚洲型舞毒蛾及其在我国常见的两种近缘种——模毒蛾和木毒蛾为研究对象,采用ISSR技术和线粒体DNA (mtDNA) Coxl基因片段对三种毒蛾的遗传多样性进行了研究,并利用四段mtDNA序列对其分子快速鉴定技术进行了研究。主要研究结果如下:(1)对ISSR-PCR反应条件和反应体系进行了优化,建立了适于三种毒蛾ISSR分析的PCR反应体系:在20μL的反应体系中含有2 μL IOxPCR buffer,0.2 mmol/L dNTP,1.75 mmol/L MgCl2,0.75 U TaqDNA聚合酶,10 ng基因组DNA模板,2.4μmol/L引物;在此基础上,从106条ISSR通用引物中筛选出稳定性好、多态性高的扩增引物7条,共获得条带65条,其中多态性条带51条,多态性条带比例为78.46%。应用POPGENE32软件,对三种毒蛾的遗传多样性和遗传距离进行分析,三个物种不同地理种群两两之间的Nei’s遗传距离变化范围在0.0003-0.1563之间。通过UPGMA聚类构建系统发育树,同一物种的不同地理种群均能够聚为一类,其中舞毒蛾的五个种群又可划分为两个大类:吉林种群和辽宁种群先聚为一类,而后与贵州种群聚为一类;内蒙古种群和黑龙江种群聚为一类。从三个物种角度而言,模毒蛾与木毒蛾聚为一类,而后与舞毒蛾聚为一类,这一结果与传统形态分类学结果一致。(2)对亚洲型舞毒蛾及其近缘种的线粒体DNA进行研究,从70对通用引物中初步筛选出20对适用于鳞翅目的通用引物,随后通过PCR筛选出4对通用引物扩增三种毒蛾的线粒体DNA,设计并筛选出10对特异性引物,其中针对舞毒蛾的特异性引物3对,模毒蛾的特异性引物4对,针对木毒蛾的特异性引物3对,并获得了10对特异性引物的最适PCR退火温度。以6个浓度梯度的基因组DNA作为模板,探索10对特异性引物的最低检测限。结果表明,GM-3能够检出最低50 pg的舞毒蛾DNA,而GM-1、GM-2仅能检出最低500 pg的舞毒蛾DNA; CM-2、CM-3均能够检出最低500 pg的木毒蛾DNA,而CM-1仅能检出最低5 ng的木毒蛾DNA;针对模毒蛾特异性扩增的四对引物分别能检出最低50 pg (NM-1、NM-3)和5ng (NM-2、NM-4)的模毒蛾DNA;对三种毒蛾的Coxl基因片段进行了序列特征分析,采用Tamura 3-parameter模型,对三种毒蛾的种内、种间遗传距离进行计算,结果表明:三种毒蛾的种内遗传距离均值均为0.004,表明三种毒蛾的种内遗传差异较小;在种间遗传差异方面,三种毒蛾的种间遗传距离均值在0.090-0.136之间。通过通过邻接法和UPGMA法,分别基于Cox1序列对舞毒蛾、模毒蛾、木毒蛾构建系统发育树,两个系统发育树基本结构一致,三种毒蛾的种内的不同个体能够各自聚为一支。