目的：　　上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是上皮细胞获得间质样特征，失去细胞间交互作用与极性，同时失去上皮细胞标志，获得间质细胞标志的一种细胞过程，与器官纤维化、肿瘤侵袭、转移、复发及耐药性密切相关。由于肺泡Ⅱ型细胞体外原代培养、维持细胞特征非常困难，国际上一般选择永生化的肺癌细胞作为细胞模型，研究EMT的发生机制。同时，肺癌发生转移，也会先发生间质转化增加迁移性，继而出现转移，因此研究EMT包括来源于上皮的癌组织转化为间质肿瘤特征的机制，对于深入研究器官纤维化、肿瘤侵袭、转移、复发及耐药性具有非常广泛的重要意义。研究进展显示，细胞氧化应激与EMT发生密切相关，正常细胞获得恶性表型及肿瘤细胞增强其恶性表型的过程是否由活性氧（ROS）调控尚不清楚。线粒体是细胞的能量产生重要场所，反映线粒体结构与功能的指标主要有细胞活力、线粒体形态、线粒体 DNA、线粒体活性氧（mtROS）、线粒体膜电位、ATP含量、线粒体生成相关蛋白包括SIRT1、PGC-1α、TFAM和NRF-1，以及线粒体呼吸链复合物等，其中线粒体复合物 Ⅰ 处于呼吸链的起始阶段，其功能异常则线粒体呼吸链功能也异常。反映上皮组织细胞特征标记物为：E-cadherin、CK18，反映上皮间质转化特征标记物为Vimentin、α-SMA的蛋白表达等。线粒体功能障碍会导致细胞代谢紊乱以及 ROS 水平的升高，而过量的 ROS 又会进一步加重线粒体的损伤，那么该过程是否对EMT的发生有促进作用有待进一步研究。本研究通过体外实验探讨转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导人非小细胞肺癌细胞系（A549）上皮间质转化模型，测定 ROS、mtROS、线粒体膜电位、ATP、线粒体生成相关蛋白以及线粒体呼吸链复合物表达量等相关指标的变化，探索线粒体功能对EMT过程的作用机制并探索线粒体保护剂白藜芦醇的干预作用效果，为阻止肿瘤的转移侵润以及纤维化过程提供新的研究思路与策略。　　方法：　　1．选择TGF-β1处理制作EMT细胞模型：体外培养人肺癌A549细胞，用不含TGF-β1的培养基培养A549细胞作为对照组；用不同浓度TGF-β1（0、5、10、20 ng/mL）刺激A549细胞作为处理组。　　2．分别用线粒体复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮（5μM）以及MnSOD模拟物（100μM） MnTmPyP分别与TGF-β1共处理。　　3．选择白藜芦醇作为线粒体功能保护剂：用TGF-β1与白藜芦醇共同处理A549细胞48h，对照组为DMSO组，处理组为TGF-β1（5 ng/mL），TGF-β1+白藜芦醇（25μM）组；　　4．构建线粒体DNA（mtDNA）缺失模型：采用50 ng/mL EB、100 mg/L 丙酮酸钠及50μg/mL 尿嘧啶进行培养后，选择mtDNA稳定缺失的细胞，模拟线粒体功能障碍；再经TGF-β1与白藜芦醇处理。　　5．通过共转染沉默信息调节因子1 （silent information regulator l，SIRT1）和PGC-1α的shRNA慢病毒，再经TGF-β1与白藜芦醇处理后，观察相关指标。在刺激后不同时间点用倒置显微镜观察细胞形态变化；CCK8法检测细胞活力；流式细胞术检测细胞凋亡；分别采用荧光探针DCFH与MitoSOX染色后，用流式细胞仪检测细胞内ROS与mtROS；罗丹明-123染色后用流式细胞仪检测细胞线粒体膜电位的变化；用线粒体荧光探针Mitotracker染色观察线粒体形态；用MILLPLEX试剂盒检测线粒体呼吸链复合物表达量；用增强型ATP检测试剂盒检测ATP含量；用Western blot 分别检测细胞中上皮间质转化相关标记物 E-cadherin、CK18、Vimentin、α-SMA 的蛋白表达水平以及线粒体生成相关SIRT1、PGC-1α、TFAM和NRF-1蛋白表达水平。采用线粒体复合物Ⅰ抑制剂鱼藤酮（5μM）以及MnSOD模拟物（100μM）处理相关指标的变化。采用SPSS16.0软件进行数据处理分析。　　结果：　　1．EMT 细胞模型的线粒体功能及上皮-间质转化指标的变化：与对照组相比， TGF-β1能剂量依赖性的促进A549细胞活力上升（P<0.05），同时未观察到TGF-β1促进细胞凋亡作用（P＞0.01）；不同浓度TGF-β1刺激A549细胞在48及72 h后大部分细胞呈现明显的间质细胞形态，出现上皮间质转化（EMT）；Western blot 结果显示，经TGF-β1刺激后，48 h、72 h组上皮标记物E-cadherin、CK18蛋白表达逐渐降低，间质标记物α-SMA、Vimentin表达逐渐升高（P<0.05）。在成功制作EMT细胞模型的同时，测定相关指标均显示明显的时间效应关系（P<0.05）：（1）流式细胞仪检测细胞内ROS及mtROS结果显示，在相同浓度下，24 h、48 h、72 h组此二者随处理时间延长而上升，呈现时间效应关系（P<0.05）；（2）抗氧化酶随处理时间延长而下降，呈现时间效应关系（P<0.05）；（3）线粒体膜电位荧光强度随处理时间延长而上升（P<0.05）；（4）线粒体呼吸链复合物蛋白表达量与ATP含量随着处理时间延长活性逐渐降低；（5）线粒体相关蛋白SIRT1、PGC-1α、TFAM和NRF-1蛋白表达水平在48、72 h组表达逐渐降低（P<0.05）。　　2．线粒体复合物Ⅰ抑制后上皮间质转化相关指标的变化：与单纯TGF-β1处理组相比，TGF-β1 与鱼藤酮共处理后，鱼藤酮促进 EMT的发生，细胞形态更加趋向间质表型；间质标志物 α-SMA、Vimentin 表达显著上调，而上皮标记物 E-cadherin、CK18蛋白表达下调更为明显，线粒体功能障碍严重，ATP和膜电位下降更为明显， mtROS增加，进一步促进了EMT发生；而MnSOD模拟物（100μM）可降低ROS，通过保护线粒体功能而阻止EMT的发生。　　3．白藜芦醇干预后上皮间质转化及线粒体功能相关指标的变化：与单纯TGF-β1处理组相比，用25 μmol/L的白藜芦醇处理，其上皮标记物E-cadherin、CK18蛋白表达显著升高，间质标记物α-SMA、Vimentin表达显著下降（P<0.05），线粒体膜电位结果显示，单纯TGF-β1处理后，膜电位下降，而用白藜芦醇处理后膜电位显著升 高（P<0.05），ATP含量增加（P<0.05），线粒体呼吸链复合物蛋白表达量下调，ROS与mtROS降低（P<0.05），线粒体生成相关蛋白表达上调（P<0.05），MitoTracker染色TGF-β1处理后线粒体分布由密集变得疏松，数量呈现一定程度下降，而白藜芦醇干预后该情况改善。　　4．制作线粒体功能障碍的细胞模型显示：mtDNA 缺失细胞呈现间质表型，在TGF-β1处理后，间质表型更明显，间质标志物α-SMA、Vimentin表达显著上调，而上皮标记物E-cadherin、CK18蛋白表达下调更明显，线粒体功能相关指标受损程度更加严重，提示线粒体功能障碍与合成受阻可促进EMT的发生。进一步给予白藜芦醇后未观察到保护作用，从而证明了白藜芦醇是依赖完整的线粒体功能而发挥阻止EMT作用的。　　5．上皮间质转化中线粒体生成相关途径的变化：共转染沉默 SIRT1、PGC-1α可降低线粒体生成相关基因TFAM和NRF1的表达，促进上皮间质转化，提示SIRT1、PGC-1α阻止EMT转化的保护作用，用TGF-β1与白藜芦醇共处理沉默SIRT1、PGC-1α的细胞，白藜芦醇保护作用减弱，也从反面证明了白藜芦醇的保护作用与 SIRT1、PGC-1α密切相关。　　结论：　　1．TGF-β1可诱导A549细胞发生上皮间质转化EMT，在此过程中伴有ROS升高及线粒体损伤。　　2．线粒体功能损伤可促进上皮间质转化，降低外源性活性氧 ROS 可抑制上皮间质转化EMT。　　3．线粒体保护剂白藜芦醇可通过保护线粒体结构和功能完整抑制EMT过程。　　4．线粒体功能障碍与合成受阻可促进EMT的发生。　　5．通过SIRT1/PGC-1α途径调控线粒体可逆转EMT的发生。