随着蛋白质组学研究的深入和发展,大量功能蛋白质和疾病相关的潜在蛋白质标志物被发现和鉴定。疾病或不同生理状态相关的重要蛋白质往往不仅是种类的改变,更多的是蛋白质量的改变。因此,从定性走向定量已经成为蛋白质组研究的必然趋势。基于质谱分析的稳定同位素化学标记分子探针的蛋白质定量组学技术在揭示生命过程的化学本质中发挥着重要作用。本文基于有机磷化学,设计并合成六标等重稳定同位素磷酰化标记分子探针(iSIPL),通过NMR、MS等方法对相关结构进行表征和鉴定,结合质谱建立动态生命过程分析的蛋白质组学定量新技术。该分子探针基于特征磷酰胺报告离子的全新结构,建立0-18、N-15及C-13等稳定同位素原子高效引入有机磷分子探针的合成方法,实现克级高产率合成与纯化方法。首先设计了二乙氧基磷酰化丙甘二肽结构,合成无稳定同位素N-磷酰化标记分子探针(iSIPLzero),并和商品化标记试剂TMTzero进行蛋白鉴定分析对比实验,结果表明,磷酰化标记探针在定浓低蛋白的鉴定分析中具有一定优势,BSA标准蛋白在2 ng/μL浓度下鉴定到肽段77个,实现88%的蛋白覆盖率。同时,对比iSIPL0和TMT0标记HELA细胞总蛋白酶解样品样品结果,发现iSIPL0标记样品稀释10倍条件下鉴定蛋白数与TMT0标记相当,TMTzero鉴定蛋白数目为2634,iSIPLzero鉴定蛋白数目为2433,其中554个为新蛋白,说明与TMT标记试剂具有互补性,若iSIPL探针分子对微量蛋白具备更强的蛋白鉴定能力,具有增敏效应。最后初步验证六标iSIPL分子探针在蛋白质定量分析中的准确性和稳定性,在标准蛋白BSA的标记定量分析中,二级质谱图中出现较高相对丰度的特征报告离子峰m/z 180、181,182、183、184和185,且蛋白肽段产生报告离子的相对强度接近3:3:3:1:1:1,与蛋白混合比例一致,说明了六标iSIPL蛋白定量分析的准确性和可行性。总之,基于有机磷化学的iSIPL标记试剂的合成与应用为蛋白质定量分析提供了一种新的多通道标记策略,为开发出性能更加优越和高效的定量分析新试剂奠定了坚实基础。