1972年Kerr等研究发现在脊椎动物正常发育过程中存在着一些细胞按预定程序消亡的现象。科学家发现了机体的细胞逐渐变小、变圆，细胞膜皱缩，并逐渐凹陷，染色质变得致密，最后形成一个个小碎片。这样的细胞死亡现象被命名为细胞凋亡(apoptosis)。 目前为止，人们已确定了三条哺乳动物细胞凋亡的信号转道通路：(1)死亡受体介导的信号通路，(2)线粒体通路，(3)内质网通路(Rap et al，2004)。线粒体是调节细胞凋亡的中心，近年来内质网被认为是调节细胞凋亡的另一个中心。转录因子CHOP(C/EBP homologous protein)被认为参与了内质网应激反应诱导细胞凋亡。但与凋亡相关的下游基因在CHOP调节下的表达变化目前大部分还不清楚，有待阐明。 二．研究目的 本文研究目的在于探讨在撤钾诱导野生型小鼠小脑颗粒神经元(cerebellar granule neurons，CGNs)凋亡中chop mRNA及蛋白表达的变化，C}tOP蛋白是否参与了撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，用chop基因敲除小鼠来研究CHOP蛋白在撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中的作用。 三．实验方法 凋亡模型的建立：取出生7-8天的野生型小鼠(即chop+/+小鼠)或者chop基因敲除小鼠(即chop(-/-)小鼠)的小脑，按每毫升1.5×10<'6>个细胞的密度体外培养7天分化成熟。体外培养7天的小脑颗粒神经元，去掉培养基后换入不含血清但含25mM KCl的基础培养基，这时小脑颗粒神经元存活，通常将这种处理称为高钾或者25K处理。当换入不含血清仅含5mMKCI的基础培养基时，随培养时间延长，神经元表现明显的凋亡特征如胞体皱缩、核固缩、DNA Ladder、凋亡小体等，神经元发生凋亡，通常将这种处理称为低钾或者5K处理。 凋亡细胞的鉴定：使用了Hoechst 33258染色观察凋亡细胞核形态学的变化与公认的细胞凋亡marker蛋白Caspase-3作为凋亡的生化指标。Hoechst 33258是一种。DNA荧光染料，可以插入并结合于DNA链的A-T区，紫光激发，可释放蓝色荧光。正常神经元核内DNA分布相对均匀，核无固缩，故在视野中呈现体积较大的浅染核形态，而凋亡中的神经元其核内DNA浓聚，核出现不同程度的固缩，故呈现体积明显缩小的深染核形态。采用免疫印迹的方法测定caspase-3，提取细胞总蛋白，在12﹪SDS-PAGE凝胶上电泳分离，然后转移至PVDF膜上用特异抗体、化学发光试剂检测。 chop基因敲除小鼠的分析鉴定：检测chop基因、chopmRNA和CHOP蛋白。采用的方法是聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction，PCR)检测chop基因； 用反转录多聚酶链式反应(RT-PCR)检测chop mRNA的表达情况；用免疫印迹的方法检测CHOP蛋白的表达情况。 CHOP蛋白在野生型小鼠撤钾凋亡模型中表达情况的研究：本论文采用RT-PCR技术检测野生型小鼠小脑颗粒神经元凋亡中chop mRNA的表达情况。主要的步骤有提取细胞总RNA，首先经反转录酶的作用从RNA合成cDNA，再以cDNA为模板，设计特异的引物扩增合成野生型小鼠目的片段。采用免疫印迹的方法检测CHOP蛋白在野生型小鼠小脑颗粒神经元凋亡的不同时间点的表达情况，方法同caspase-3的检测。 野生型小鼠和chop基因敲除小鼠小脑颗粒神经元凋亡率的比较：采用的方法是在不同时间点建立野生型小鼠和chop敲除小鼠小脑颗粒神经元凋亡模型，进行Hoechst 33258核染色，荧光显微镜拍照，凋亡细胞的计数和凋亡率的统计及比较。我们的所有试验数据均用ANOVA统计计算，以均数(+/-)标准误差(mean±s)表示。 四．实验结果 1．撤钾诱导野生型小鼠小脑颗粒神经元凋亡时chop mRSA表达量增加。25K、5K处理小脑颗粒神经元，处理时间分别为1、2、4、8小时。用特异的引物进行RT-PCR检测，显示：同25K处理比较，5K处理小脑颗粒神经元的chop mRNA表达量增高。 2．撤钾诱导野生型小鼠小脑颗粒神经元凋亡时CHOP蛋白表达量增高。 25K、5K处理小脑颗粒神经元，处理时间分别为2、4、8、12小时。用特异的CHOP抗体进行Western Blot检测显示：同25K处理比较，5K处理小脑颗粒神经元的CHOP蛋白表达量增高，在8小时和12小时，CHOP表达量增高明显。 3．撤钾诱导的chop基因敲除小鼠和野生型小鼠小脑颗粒神经元凋亡率无统计学差异。25K、5K分别处理野生型小鼠的小脑颗粒神经元和chop基因敲除小鼠的小脑颗粒神经元，处理时间分别为6、8、12、24小时，25K、5K处理的野生型小鼠小脑颗粒神经元作为对照。Hoechst 33258核染色显示，25K处理的野生型小鼠的小脑颗粒神经元凋亡率在6、8、12、24小时分别为8﹪±1﹪、12﹪±6﹪、18﹪±7﹪、24﹪±1﹪(mean±s，n=3)，5K处理的野生型小鼠的小脑颗粒神经元凋亡率在6、8、12、24小时分别为43﹪±7﹪、55﹪±5﹪、69﹪±8﹪、68﹪±1﹪(mean±s，n=3)；25K处理的chop基因敲除小鼠的小脑颗粒神经元凋亡率在6、8、12、24小时分别为12﹪±2﹪、18﹪±1﹪、25﹪±3﹪、37﹪±4﹪(mean±s，n=3)，5K处理的chop基因敲除小鼠的小脑颗粒神经元凋亡率在6、8、12、24小时分别为39﹪±4﹪、50﹪±1﹪、62﹪±6﹪、82﹪±1﹪。chop基因敲除小鼠和对照组相比，对撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡率的影响并无差别(t-test，P>0.05)。 五．结论 总之，本文探讨在撤钾诱导野生型小鼠小脑颗粒神经元凋亡中chop mRNA及蛋白表达的变化，采用chop基因敲除小鼠来研究CHOP蛋白在撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡中的作用。首次发现了撤钾诱导野生型小鼠小脑颗粒神经元凋亡中chop mRNA和CHOP蛋白表达增高的依据，但是，chop基因敲除小鼠和对照组相比，对撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡率的影响并无差别，提示CHOP蛋白可能不参与撤钾诱导的小脑颗粒神经元凋亡，CHOP蛋白不是小脑颗粒神经元凋亡必需的。这对进一步阐明CHOP基因与细胞凋亡的关系具有重要的意义。并且，为今后研究凋亡细胞通过何种机制来诱导chop mRNA和CHOP蛋白表达增高提出了的新课题。