小麦(Triticum aestivum L.)是我国重要的粮食作物。小麦生长过程中常常遭受环境胁迫的危害,进而导致生长抑制和产量降低。通过基因工程技术提高小麦的逆境适应性是小麦新品种培育的发展方向。研究逆境相关基因功能可以为小麦基因工程育种奠定理论基础,储备基因资源。扩展蛋白是一种调节细胞壁松弛和细胞延伸生长的细胞壁蛋白,普遍存在于植物所有的细胞、组织和器官中。1989年美国宾夕法尼亚州立大学Cosgrove教授的实验室研究黄瓜下胚轴细胞延伸性生长,并首次发现了扩展蛋白(Expansin)。近年来,扩展蛋白的研究成果不断丰富。现已证明扩展蛋白参与多种植物生长发育过程及逆境适应性响应。但是,由于小麦基因组较大、遗传背景复杂以及转化效率低等问题,小麦扩展蛋白基因功能的研究报道较少。扩展蛋白由多基因家族编码,家族成员之间在基因结构、蛋白结构、生化特性、进化关系等方面存在多方面的异同。其中EXPA和EXPB是两个最大、研究最清楚的基因家族。本实验室先前克隆了小麦EXPB家族基因Ta EXPB23,发现该基因的表达对多种非生物胁迫和激素信号产生响应。组成型过表达、根特异性以及胁迫诱导表达该基因均增强了转基因烟草的抗旱性。鉴于EXPA和EXPB家族成员存在多方面的异同,本研究中选择小麦EXPA基因Ta EXPA2(Gen Bank accession number:AAT94292.1),利用过量表达技术研究该基因在植物生长发育及逆境适应中的作用,分析其生理机制,并与EXPB家族基因Ta EXPB23的功能相比较,为解释不同家族基因功能上的异同点提供参考。首先克隆了Ta EXPA2的启动子区域,预测分析了该启动子的顺式作用元件。分析了该基因的时空表达、激素响应和逆境响应表达模式;构建Ta EXPA2基因表达载体,转化烟草获得了转基因植株;利用过表达Ta EXPA2的转基因烟草,研究了该基因在植物生长发育调节、耐旱、耐盐中的作用,并进一步探讨了其生理机制;最后,为研究深入探讨过表达扩展蛋白提高转基因植株抗氧化能力的分子机制,利用拟南芥同源基因突变体atexpa2,并将Ta EXPA2在突变体atexpa2中进行过表达回补实验,初步分析了扩展蛋白与细胞壁过氧化物酶之间的关系。研究主要结果与结论如下:(1)利用Tail-PCR克隆技术获得了Ta EXPA2基因启动子区域1073bp的片段(Gen Bank ID:KP729264),用Plant CARE和PLACE功能预测软件对其进行了分析,结果表明该启动子区域含有多种光响应元件、组织特异表达元件、多种激素响应元件和逆境(干旱、ABA和高温)响应元件。(2)将Ta EXPA2::GFP融合蛋白在洋葱表皮中瞬时表达,证实Ta EXPA2蛋白定位于细胞壁。(3)q RT-PCR检测了小麦中Ta EXPA2基因表达的组织特特异性以及对外源激素和非生物胁迫的响应模式。结果表明,Ta EXPA2在小麦根、茎、叶中均有表达,叶片中的表达量最高;Ta EXPA2基因表达对多种逆境胁迫和外源激素处理产生响应,干旱胁迫诱导基因表达水平上调。(4)构建Ta EXPA2转化载体,转化烟草获得了不同水平过表达Ta EXPA2的转基因烟草株系。对转基因烟草的生长发育表型进行观察记录,结果发现过表达Ta EXPA2提高了转基因烟草的种子产量和果荚数,但是没有改变转基因烟草营养生长表型及种子的大小。(5)对转基因烟草进行干旱胁迫处理,观察了萌发率、幼苗生长和成苗生长,结果发现过表达Ta EXPA2提高了转基因烟草的抗旱性。从水分保持能力、光合作用特性、抗氧化特性等方面研究了转基因烟草抗旱性提高的生理机制,发现转基因烟草抗旱性的提高与根系发达、水分状况维持能力强以及抗氧化能力较强有关。抗氧化能力的提高与相关基因表达上调有关。(6)对转基因烟草进行盐胁迫处理,观察了盐胁迫种子萌发、幼苗生长和成苗生长,结果发现过表达Ta EXPA2提高了转基因烟草的抗盐性。具体表现在盐处理以后,转基因烟草的萌发率更高,幼苗和成苗的生长状况较WT更好。从渗透胁迫耐性、离子胁迫耐性和抗氧化能力等方面探讨了转基因烟草耐盐性提高的生理机制,结果发现,烟草胁迫下转基因烟草的水分维持能力强,细胞内Na+离子积累较WT少而K+积累较WT多,抗氧化能力较WT强。特别地,用转基因烟草叶片细胞壁蛋白孵育的野生型叶圆片的抗盐性增强,且转基因烟草叶圆片增强的抗盐性可以被Ta EXPA2抗体抑制。结果表明,转基因烟草抗盐性的提高可能与钠、钾离子稳态调节和抗氧化能力增强有关。(7)初步研究了ABA信号在Ta EXPA2介导的耐盐性中的作用。用脱落酸(ABA)和Na Cl处理小麦幼苗,发现ABA和Na Cl均可以诱导小麦叶片中Ta EXPA2蛋白的积累,但是ABA的抑制剂氟啶酮(FLU)抑制小麦中Ta EXPA2蛋白的积累;同时使用Na Cl和FLU处理小麦时,Ta EXPA2蛋白的积累受到抑制。说明ABA信号与Na Cl诱导的Ta EXPA2蛋白积累有关。但是,转基因烟草中,ABA的合成基因的表达水平无论在正常情况下还是盐处理后都比野生型低。这些结果说明,ABA信号参与了Ta EXPA2调控的转基因烟草的抗盐性。(8)利用拟南芥同源基因突变体atexpa2研究过表达Ta EXPA2提高转基因烟草抗氧化能力的生理与分子机制。用H2O2处理小麦,检测Ta EXPA2的表达水平,发现Ta EXPA2的表达受过氧化氢诱导上调。将Ta EXPA2基因在拟南芥中过表达,发现过表达Ta EXPA2的转基因拟南芥对过氧化氢引起的氧化胁迫的抗性明显增强。研究转基因拟南芥抗氧化能力提高的生理机制,发现转基因拟南芥抗氧化能力的提高与植物细胞壁键连的过氧化物酶关系密切。用Ta EXPA2基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)同源基因突变体atexpa2进一步验证发现,与Col-0野生型相比,突变体atexpa2的细胞壁键连过氧化物酶活性明显较低,抗氧化胁迫能力较Col-0显著降低。将Ta EXPA2基因过表达回补到突变体atexpa2后,转基因拟南芥的抗氧化能力增强,并且拟南芥中三种过氧化物酶的活性增强。这些结果初步证明,Ta EXPA2与细胞壁POD之间关系密切。推测细胞壁扩展蛋白Ta EXPA2可能通过与细胞壁键连的过氧化物酶互作,对转基因植株的氧化胁迫能力产生影响。该结果对于解释过表达扩展蛋白提高植物的胁迫耐性具有重要意义。