子宫内膜异位症指有活性的子宫内膜组织在子宫体以外的部位出现、生长、浸润,反复出血,常表现为痛经、慢性盆腔痛、性交痛和不孕等,严重影响生活质量。研究发现异位病灶中存在的纤维化组织可能是引起子宫内膜异位症多种临床症状的重要原因。子宫内膜中的间充质干细胞随着经血逆流到达腹腔,被认为是产生子宫内膜异位症的“种子”,子宫内膜异位症持续存在且容易复发的重要原因是子宫内膜间充质干细胞具有无限增殖和多向分化的潜能。间充质干细胞在纤维化疾病中发挥关键的作用,多种组织来源的间充质干细胞可分化为肌成纤维细胞,促进纤维化的发生发展。间充质干细胞的分化方向受微环境的影响。在子宫内膜异位症的发生过程中,随着经血逆流到达腹腔的子宫内膜间充质干细胞在多种生物活性因子异常表达的腹腔内环境中种植生长。因此,我们猜测子宫内膜异位症患者腹腔液成分可能促进子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化,引起异位病灶的纤维化,在子宫内膜异位症的进展中,纤维化逐渐加重。根据以上猜测,本课题探究了异位内膜纤维化与子宫内膜异位症进程之间的关系,子宫内膜异位症患者腹腔液在子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化中的作用及其机制,并开展了子宫内膜异位症纤维化干预的体内外研究。全文分为四部分:第一部分异位内膜纤维化与子宫内膜异位症进程之间关系的研究一、目的从人正常内膜、子宫内膜异位症患者在位、异位内膜组织的比较,不同严重程度子宫内膜异位症患者异位内膜的比较,小鼠模型中子宫内膜异位症不同进展时期的异位内膜的比较,三个方面探讨异位内膜纤维化与子宫内膜异位症进程之间的关系。二、方法1.收集人正常子宫内膜组织和子宫内膜异位症患者的在位、异位内膜组织,采用Masson染色法分别检测其中胶原沉积情况,利用IPP6.0软件对胶原沉积面积占子宫内膜组织的面积进行量化分析。2.根据r-AFS标准将收集的异位内膜分为Ⅰ/Ⅱ期和Ⅲ/Ⅳ期两组,利用Masson染色和IPP6.0分析比较两组异位内膜的纤维化程度。3.免疫组化检测正常子宫内膜和子宫内膜异位症患者在位、异位内膜组织中纤维化蛋白 collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin 和 CTGF 的表达,IPP6.0 测定 MOD以评价其表达强度。4.建立子宫内膜异位症小鼠模型,分别于造模后第7、14、21天收集异位子宫内膜组织,Masson染色法检测胶原沉积情况,免疫组化检测collagen I、α-SMA、fibronectin和CTGF的表达,并利用IPP6.0进行量化分析。三、结果1.异位内膜的纤维化程度显著高于在位内膜和正常内膜。2.r-AFS分期为Ⅲ/Ⅳ期患者异位病灶的纤维化程度显著高于Ⅰ/Ⅱ期患者。3.异位内膜中collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin和CTGF的表达水平显著高于在位内膜和正常内膜。4.在造模后的第7天,小鼠异位内膜中的胶原沉积和纤维化相关蛋白的表达量极低,在造模后的第14天则明显增加,而且在造模后的第21天维持在更高的水平。四、结论1.异位内膜的纤维化程度和纤维化蛋白表达水平显著高于正常内膜和在位内膜。2.分期严重的子宫内膜异位症患者异位内膜的纤维化程度更重。3.随着子宫内膜异位症的发展,异位病灶中的纤维化程度逐渐加重,纤维化蛋白表达逐渐升高。第二部分子宫内膜异位症患者腹腔液在子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化中的作用研究一、目的从临床样本中寻找子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的证据,并通过体外分离培养人子宫内膜间充质干细胞,进一步分析子宫内膜异位症患者腹腔液在子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化中的作用。二、方法1.通过免疫荧光实验分别在人正常内膜、子宫内膜异位症患者在位、异位内膜组织中检测子宫内膜间充质干细胞标记物SUSD2与肌成纤维细胞标记物α-SMA的共定位情况。2.分离、培养、鉴定人正常、在位、异位子宫内膜间充质干细胞,比较正常、在位、异位内膜间充质干细胞和非间充质干细胞中collagen I、α-SMA、fibronectin和CTGF的表达水平。3.分别用子宫内膜异位症患者腹腔液和对照组腹腔液处理子宫内膜间充质干细胞,检测细胞中collagen I、α-SMA、fibronectin和CTGF的表达水平和Smad2、Smad3的活化情况。4.CCK-8法检测子宫内膜异位症患者腹腔液和对照组腹腔液对正常、在位、异位内膜中的间充质干细胞和非间充质干细胞增殖的影响。三、结果1.在正常内膜和在位内膜中SUSD2和α-SMA排列整齐地表达于血管周,但是二者却极少存在共定位。然而在异位内膜中,SUSD2和α-SMA呈现散在分布,而且二者的共定位广泛存在。2.在光镜观察下,人正常、在位、异位子宫内膜间充质干细胞均呈现长梭形、纺锤体的形态并呈旋涡状排布。经鉴定,这些细胞表达CD44、CD72、CD90、CD105、CD146、HLA-ABC,不表达 CD14、CD31、CD34、CD45、CD117、HLA-DR,且具有成脂、成骨多向分化潜能,符合间充质干细胞特征。3.异位内膜间充质干细胞表达collagen I、α-SMA、fibronectin和CTGF的水平高于正常、在位内膜间充质干细胞。子宫内膜非间充质干细胞表达collagen I、α-SMA、fibronectin和CTGF的水平高于子宫内膜间充质干细胞。4.子宫内膜异位症患者腹腔液诱导子宫内膜间充质干细胞中collagenI、α-SMA、fibronectin、CTGF表达和Smad2、Smad3活化的能力显著强于对照组腹腔液。5.子宫内膜异位症腹腔液和对照组腹腔液都可以轻微抑制正常内膜间充质干细胞增殖,并轻微促进在位、异位内膜间充质干细胞增殖,两种腹腔液的作用并无明显差异。子宫内膜异位症腹腔液作用时,在位、异位子宫内膜非间充质干细胞的增殖能力显著高于对照腹腔液处理组,正常内膜非间充质干细胞增殖能力显著低于对照腹腔液组。四、结论1.在异位病灶中子宫内膜间充质干细胞能够向肌成纤维细胞分化。2.成功分离培养了原代正常、在位、异位子宫内膜间充质干细胞。异位内膜间充质干细胞比正常、在位内膜间充质干细胞更容易向肌成纤维细胞分化,而且已分化的子宫内膜非间充质干细胞表达更多的纤维化蛋白。3.子宫内膜异位症腹腔液能够强烈诱导子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化。4.腹腔液主要影响子宫内膜非间充质干细胞的增殖能力,而对子宫内膜间充质干细胞的影响则主要为分化方面。第三部分子宫内膜异位症患者腹腔液中Activin A在子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化中的作用机制研究一、目的明确子宫内膜异位症患者腹腔液中促进子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的关键成分,并探讨其作用机制。二、方法1.结合文献报道的子宫内膜异位症患者与正常妇女腹腔液细胞因子芯片数据,利用临床收集的子宫内膜异位症患者及正常妇女腹腔液,扩大样本通过ELISA 法检测腹腔液中 Activin A、Follistatin、DKK-1 和 DKK-4 的水平。2.CCK-8法检测ActivinA对子宫内膜间充质干细胞增殖的影响。3.Western blot和real-time PCR检测Activin A对子宫内膜间充质干细胞中collagen I、α-SMA、fibronectin、CTGF蛋白水平和mRNA水平表达的影响。4.Western blot和免疫荧光检测Activin A对子宫内膜间充质干细胞中Smad2、Smad3磷酸化和转运入核的影响。5.免疫荧光检测人正常内膜、子宫内膜异位症患者在位、异位内膜组织中Activin A和SUSD2共定位的情况。Western blot检测正常、在位、异位内膜间充质干细胞中Activin A和ALK4的表达。6.ChIP实验检测Smad2/3和CTGF的启动子结合情况。7.加入重组CTGF及转染LV-shCTGF检测CTGF对子宫内膜间充质干细胞中ACTA2、COL1A1、Fibronectin 的转录调控作用。8.Western blot检测Activin A对子宫内膜间充质干细胞中Akt、p-38、JNK和STAT3通路活化的影响,根据实验结果加入相应抑制剂验证对CTGF表达和Smad2、Smad3活化的影响。三、结果1.Activin A在子宫内膜异位症患者腹腔液中的水平特异性升高。2.ActivinA不影响子宫内膜间充质干细胞增殖。3.Activin A 可以上调纤维化相关基因 ACTA2、COL1A1、CTGF、Fibronectin mRNA和蛋白水平的表达,但是其诱导collagen I、α-SMA和fibronectin蛋白水平的上调程度远远高于其mRNA水平的上调程度,而Activin A诱导后CTGF mRNA水平和蛋白水平的表达均可升高到十倍以上。4.ActivinA可以诱导子宫内膜间充质干细胞中Smad2、Smad3磷酸化和转运入核。5.ActivinA几乎表达于所有子宫内膜细胞中,且与子宫内膜间充质干细胞的标记物SUSD2存在共定位。异位内膜间充质干细胞中Activin A及其受体水平高于正常、在位内膜间充质干细胞。6.Activin能够诱导Smad2/3结合于CTGF的启动子序列。7.Activin A诱导子宫内膜间充质干细胞表达ACTA2、COL1A1和Fibronectin依赖于CTGF。8.STAT3通过Smad2、Smad3调控子宫内膜间充质干细胞中CTGF的表达。四、结论1.子宫内膜异位症患者腹腔液中特异性升高的Activin A极有可能是子宫内膜异位症患者腹腔液中引起子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的关键成分。2.异位内膜间充质干细胞中Activin A通路激活程度显著高于正常、在位子宫内膜间充质干细胞。3.细胞外的Activin A诱导子宫内膜间充质干细胞中STAT3活化以及Smad2/3磷酸化、转运入核,Smad2/3结合于CTGF启动子促进其转录,CTGF的表达升高引起其他纤维化蛋白表达升高,是子宫内膜异位症纤维化发生发展的重要机制。第四部分ActivinA抑制剂对子宫内膜异位症纤维化的干预研究一、目的通过体内外实验探讨Activin A抑制剂对子宫内膜异位症纤维化的干预作用。二、方法1.加入 SB431542、αActivin A 和 Follistatin 三种 Activin A 信号通路的抑制剂,检测Activin A对子宫内膜间充质干细胞中Smad2、Smad3活化和纤维化蛋白表达的影响。2.建立小鼠子宫内膜异位症模型,造模次日将其分为四组:对照组、Activin A组、αActivinA组、Activin A+αActivinA组,连续腹腔注射21天,收集小鼠异位子宫内膜组织。3.Masson染色法检测胶原沉积情况,免疫组化检测纤维化相关蛋白collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin和CTGF的表达,并利用IPP6.0进行量化分析。三、结果1.三种抑制剂SB431542、αActivin A和Follistatin均可以显著抑制Activin A所诱导的子宫内膜间充质干细胞中Smad2、Smad3磷酸化、转运入核,以及纤维化相关蛋白 collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin、CTGF 的表达。2.对照组小鼠异位内膜中出现明显的胶原纤维沉积。ActivinA组小鼠异位内膜纤维化明显比对照组严重,而αActivin A作用后,小鼠异位病灶纤维化程度则明显减轻,而且αActivin A可以抑制Activin A所引起的胶原纤维过量沉积。3.Activin A 组小鼠异位内膜中 collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin 和 CTGF 的表达水平均显著高于对照组,而αActivin A组小鼠异位内膜中collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin和CTGF的表达水平却明显低于对照组。αActivin A+Activin A组异位内膜中collagen Ⅰ、α-SMA、fibronectin和CTGF的表达水平虽然略高于α Activin A组,却显著低于对照组和Activin A组。四、结论抑制腹腔液中Activin A能够控制子宫内膜异位症纤维化的发生发展。本研究的特色与创新之处:1.首次发现子宫内膜异位症患者腹腔液能够强烈诱导人子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化,从而促进子宫内膜异位症纤维化的发生发展,进一步补充了子宫内膜异位症的发病机理,为子宫内膜异位症临床药物的开发提供了新思路。2.发现子宫内膜异位症患者腹腔液中特异性升高的Activin A极有可能是子宫内膜异位症患者腹腔液中引起子宫内膜间充质干细胞向肌成纤维细胞分化的关键成分,抑制Activin A能够控制子宫内膜异位症纤维化的发生发展,为临床治疗子宫内膜异位症纤维化提供了实验基础和理论依据。3.成功建立并完善人正常子宫内膜间充质干细胞、子宫内膜异位症在位、异位子宫内膜间充质干细胞原代培养体系,为今后开展子宫内膜异位症及子宫内膜相关疾病研究提供了良好的实验基础。