研究的背景及目的创面迁延不愈合是临床医师遇到的最常见、最棘手的问题之一。手术彻底清创是治疗慢性创面的关键,然而去除感染及坏死组织后,如何促进并加快创面愈合是每个外科医生都会遇到的难题。由于自体皮肤或皮瓣移植的有限性和异体皮肤移植的排斥反应,促进人们开始寻找新型的生物替代材料来治疗创面。随着分子生物学技术和材料学的发展,多种天然生物材料已被广泛应用于慢性创面的治疗中,并取得了一定的效果。然而,这些天然支架材料不具备真正皮肤软组织的排泄、吸收等生理功能,而且在降解过程中避免不了化学残留及异物蛋白污染等缺点。因此,深入研究创面愈合过程中的具体机制,研发新型创面材料是目前亟需解决的问题。富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)因富含血小板及高浓度的各种细胞因子、纤维蛋白而被广泛应用于多种疾病的治疗。腺苷是血小板代谢产物的一种重要成分,通过激活腺苷受体,从而影响细胞的多种生物学活性。近年来研究表明,腺苷通过激活成纤维细胞中的A2A受体来促进成纤维细胞的活性。虽然富血小板血浆已被证明具有促进创面愈合的作用,然而其是否通过释放腺苷,激活A2A受体来影响成纤维细胞的活性,目前尚不得知。除此之外,由于富血小板血浆在体外的生物活性周期短,是否可以通过多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆,延长富血小板血浆的生物活性周期,从而更好的促进创面愈合。因此,在本次研究中,我们主要探讨富血小板血浆对成纤维细胞增殖、迁移和凋亡的影响及其具体分子机制。此外,我们将检测负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶的性能,并通过体外实验验证负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶对大鼠创面的治疗效果。第一部分富血小板血浆对成纤维细胞的影响目的:观察富血小板血浆在体外对成纤维细胞增殖、迁移和凋亡的影响。方法:1.富血小板血浆的制备:4周龄大小体重约100～110g SD大鼠,从每只大鼠心脏中用含0.5 m L柠檬酸钠抗凝剂的注射器抽全血至5 m L,充分混匀后,离心管500x g下离心10 min,可见血液分成三层。取最上层的液体移至新的离心管中,在2200x g下离心10 min,可见液体分成两层,上层上清液为贫血小板血浆(platelet-poor plasma,PPP),下层为血小板浓缩物(platelet concentrate,PC)。吸取大部分上清液弃掉,剩余约1.2 m L摇匀,即可得到PRP。2.利用CCK8检测不同浓度富血小板血浆对成纤维细胞活性的影响。实验分为6组:Control组(PBS)、10%PRP组、20%PRP组、30%PRP组、40%PRP组和50%PRP组。在96孔中植入5x10~3/100 m L的细胞,每组设立5个复孔,分别培养0 h、24 h、48 h、72 h后,加入10μL的CCK8试剂,96孔板孵育2 h后,检测各孔的吸光光度值。3.通过Western blot,PCR和流式细胞周期的方法观察富血小板血浆对成纤维细胞增殖能力的影响。实验分为2组:Control组(PBS)和50%PRP组。对6孔板中生长状态良好的成纤维细胞分别给予PBS和50%PRP干预,24 h后通过流式细胞技术对细胞的周期进行评估,并采用Western blot和q RT-PCR技术对细胞的周期蛋白Cyclin D1和Cyclin D3进行检测。4.通过Transwell迁移实验检测不同浓度富血小板血浆对成纤维细胞迁移能力的影响。实验分6组:Control组(PBS)、10%PRP组、20%PRP组、30%PRP组、40%PRP组和50%PRP组。按在12孔板的每孔中加入1 m L含上述浓度PRP的无血清培养基,然后将成纤维细胞用DMEM配置成浓度为5x10~5/m L的细胞悬液,将100μL此细胞悬液加入到Transwell小室内,置于上述12孔板内。在培养箱中孵育24 h后,通过结晶紫染色观察迁移到Transwell小室滤膜下层细胞。5.通过流式凋亡的方法探索富血小板血浆对成纤维细胞凋亡的影响。实验分为6组:Control组(PBS)、10%PRP组、20%PRP组、30%PRP组、40%PRP组和50%PRP组。6孔板中生长状态良好的成纤维细胞分别给予PBS和50%PRP干预,24 h后通过流式细胞技术对细胞的凋亡进行评估。6.通过生化检测的手段分别检测普通血浆和富血小板血浆中腺苷的水平。分别收集正常血浆和富血小板血浆,通过ELISA试剂盒检测两种血浆中腺苷的水平。7.观察腺苷A2A受体抑制剂和富血小板血浆对成纤维细胞功能的影响。实验分为两组:PRP组、PRP+A2A受体抑制剂组两组。通过CCK8,western blot,q RT-PCR,transwell小室和流式细胞仪检测细胞的增殖、迁移和凋亡情况。结果:1.富血小板血浆可以促进成纤维细胞增殖和迁移,抑制成纤维细胞凋亡。2.富血小板血浆中腺苷的表达水平明显升高。富血小板血浆促进成纤维细胞的功能在加入腺苷A2A受体抑制剂后,其对成纤维细胞的正向调控作用明显减弱。结论:富血小板血浆可通过释放腺苷,激活成纤维细胞中的A2A受体,从而促进细胞的增殖、迁移,抑制细胞凋亡。然而,由于富血小板血浆中还含有多种丰富的细胞因子,这些细胞因子对成纤维细胞功能的影响,尚需进一步研究。第二部分多肽纳米纤维水凝胶的制备及负载富血小板血浆的缓释性能检测目的:制备多肽纳米纤维水凝胶,并检测其负载富血小板血浆后的缓释性能。方法:1.制备多肽纳米纤维水凝胶:IKVAV、FGL-PA和RGD三种多肽购买自上海波泰生物科技有限公司。将三种多肽混合溶液(0.1 m L)加入到蒸馏水中,随后稀释到0.6 mg/m L。取0.1 m L的混合溶液,加入0.1 m L的DMEM/F12,引发自组装。2.观察多肽纳米纤维水凝胶的形态:取10μL多肽纳米纤维水凝胶至铜网上,透视电镜下观察水凝胶的形态。3.检测多肽纳米纤维水凝胶的粒径:蒸馏水稀释多肽纳米纤维水凝胶50倍后,通过Nanosight粒度分析仪检测水凝胶的粒径。4.制备载有富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶:按1:1的比例,向多肽纳米混合液中加入等体积的PRP,加入0.1 m L的DMEM/F12,引发自组装。将载有PRP的多肽纳米纤维水凝胶复合物用蒸馏水稀释100倍。通过紫外分光光度计,检测上清和沉淀的吸光度,计算药物的包封率。5.检测多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆的缓释性能:取0.1 m L负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶置于12孔细胞培养板中,每孔加入1 m L PBS,在不同时间段使用紫外分光光度仪检测每孔的吸光光度值,计算累积释放率。结果:通过透射电镜观察,证实了我们成功合成了多肽纳米纤维水凝胶;通过Nanosight粒度分析仪检测,发现我们制备的多肽纳米纤维水凝胶的平均粒径为186.1±7.2 nm,符合纳米级的要求。经紫外分光光度仪检测后,我们发现富血小板血浆的包封率为95.73±3.21%;在第96 h后,我们发现上清中的富血小板血浆的含量基本达到了所负载的含量。结论:负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶具有较高的载药量和较长的缓释时间,可以作为一种较好的复合材料。第三部分多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆在创面修复中的作用目的:评估多肽纳米纤维水凝胶负载富血小板血浆对大鼠背部创面愈合的影响。方法:1.建立大鼠背部皮肤创面模型:40只重量约为320 g的SD雄性大鼠。大鼠给予50 mg/kg,1%的戊巴比妥钠腹腔注射后,刮除大鼠背部毛发。在大鼠的背部正中做一直径1.5 cm约圆形创面。2.创面给予不同的干预措施:将大鼠随机分为四组,分别于术后第0 d、3 d、5 d、7 d分别给予PBS,富血小板血浆、多肽纳米纤维水凝胶以及负载富血小板血浆的多肽纳米水凝胶处理,动态观察大鼠背部创面愈合情况。3.计算大鼠背部创面的愈合速度:在术后第0 d、3 d、7 d、10 d和14 d,使用数码照相机对创面进行拍照,并通过Image J软件计算创面的面积。4.通过多普勒超声观察创面血流灌注情况:在术后第10 d,使用点状激光成像技术评估创面血流灌注情况。随后使用PIMSoft软件分析创面的图像,以计算MPU的比率。5.检测创面中相关蛋白的表达情况:在术后第14 d,麻醉状态下处死大鼠后,切取部分大鼠创面的组织,提取组织中的总蛋白,检测胶原蛋白I、胶原蛋白III、金属基质蛋白酶3、金属基质蛋白酶9以及α-平滑肌激动蛋白的表达水平。6.对创面局部组织进行石蜡包埋,并行HE染色和CD31染色:在术后第14 d,收集每组大鼠创面处的组织,进行石蜡包埋,随后对组织进行切片,行HE染色和CD31免疫组化染色,评估创面的宽度和创面处新生血管情况。结果:通过动态观察大鼠背部创面的面积、收缩度等指标,我们发现富血小板血浆、多肽纳米纤维水凝胶和负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶均可以促进创面愈合,其中负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组大鼠的创面愈合最佳。Western blot结果显示负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组增殖相关蛋白表达水平最高;多普勒观察到负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组大鼠的创面血流灌注量最大;HE染色和CD 31免疫组化显示负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组大鼠的创面增生最佳,局部创面新生血管最丰富。结论:富血小板血浆、多肽纳米纤维水凝胶和负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶均可以促进创面愈合。负载富血小板血浆的多肽纳米纤维水凝胶组大鼠的创面愈合效果更好,可以作为创面修复的治疗提供一种新型材料。