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近年来我国空气颗粒物(Particulate matter,PM)污染日益严重,已逐渐成为危害我国居民身体健康的重要环境因素之一,其中PM2.5(Particulate matter 2.5)对人体的危害尤为严重。大量流行病学调查发现,PM2.5与人群心血管系统疾病的发生率和死亡率密切相关,是威胁人类心血管系统的一个重要环境因素,但目前颗粒物对心血管系统的损伤机制尚未完全阐明。氧化损伤可能是颗粒物引起心血管损伤的重要途径之一。白藜芦醇(resveratrol,RSV)是具有生物学活性的多酚类化合物,是一种天然的抗氧化剂,多项研究表明RSV具有保护心血管的功能。核因子NF-E2相关因子2(nuclear factor-erythroid 2 related factor 2,Nrf2)是一种细胞内的重要的核转录因子,其功能与抗氧化系统相关。RSV可以通过促进某类细胞Nrf2的mRNA合成以及蛋白核转位,提高机体抗氧化水平,减轻氧化损伤。而PM2.5作用于血管内皮细胞后氧化损伤情况如何,RSV干预有何种效应,与Nrf2的调控功能是否关联,此方面研究较少。体外细胞模型能够用以探究PM2.5直接作用于人体血管内皮细胞并对其造成损伤的毒性特征与可能机制,与体内实验相比,体外实验具有预测性强、灵敏度高、耗费少,无种属差异等特点,实验过程中能够更准确的控制PM2.5对靶细胞的暴露条件因素。目的针对PM2.5可溶组份及部分微粒能够进入人体血液循环并直接对心血管造成毒性损伤,本研究采用体外实验的方法,探讨武汉地区PM2.5对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的氧化损伤效应以及RSV干预对损伤的影响。为控制PM2.5内暴露水平以及防治PM2.5的心血管损伤提供新的参考。方法本课题第一部分探讨PM2.5对HUVEC细胞的氧化损伤作用,主要指标包括基本细胞毒性、活性氧(ROS)含量、细胞内抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性、以及脂质和脱氧核糖核酸(DNA)的氧化损伤等指标。以不同浓度PM2.5混悬液(0-250μg/cm2)作用于HUVEC细胞,染毒24 h后采用CCK-8法检测细胞存活率。以0、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25μg/cm2的染毒剂量分别处理HUVEC细胞1 h、3 h,应用H2-DCFDA荧光探针法检测HUVEC细胞内活性氧(ROS)的生成;以相同染毒剂量分别处理HUVEC细胞24 h,应用比色法检测SOD和GPx的活力性以及脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量,用单细胞凝胶电泳方法分析细胞拖尾率以反应其DNA损伤程度。分别以1mm或2mm浓度的n-乙酰半胱氨酸(nac)与pm2.5染毒液(31.25μg/cm2)共同作用huvec,以cck-8法检测染毒24h细胞存活率,用荧光显微镜观察染毒3h后细胞h2-dcfda染色呈现的ros荧光强度。本课题第二部分考察了rsv干预对pm2.5致huvec细胞氧化损伤的影响。用cck-8法检测0-320μm浓度的rsv对huvec细胞抑制率。选用0、2.5、5、10μm浓度的rsv对细胞预处理12h,而后分别给予0、31.25μg/cm2的pm2.5染毒24h,cck-8法检测各组细胞存活率。选择0、10μm的rsv预处理细胞12h,而后分别给予0、31.25μg/cm2的pm2.5染毒,分别检测huvec细胞内ros与mda的生成,并采用westernblot检测nrf2核蛋白含量和锰超氧化物歧化酶(sod-2)的蛋白水平。结果随pm2.5染毒剂量的升高,huvec细胞存活率逐渐降低,与溶剂对照组相比pm2.5≥7.81μg/cm2的各染毒组细胞存活率显著降低(p<0.05),经计算,ic50为156.94μg/cm2。pm2.5作用1h、3h后,细胞内ros生成水平呈剂量依赖性升高;pm2.5作用24h后,抗氧化酶sod与gpx活力呈剂量依赖性降低,脂质过氧化指标mda含量和dna损伤指标细胞拖尾率呈剂量依赖性上升。与溶剂对照组相比,pm2.5≥15.63μg/cm2剂量组细胞gpx活力显著降低(p<0.05),pm2.5≥7.81μg/cm2剂量组细胞sod活力显著降低、mda水平显著升高、彗星试验的细胞拖尾率显著升高(p<0.05)。ros是人体在维持生命活动中产生的一种代谢物质,在正常生理状况下,ros水平极低,与人体抗氧化防御系统共同维持着体内氧化还原状态平衡。本实验中huvec受到pm2.5刺激,导致细胞内ros生成增多,造成氧化-抗氧化系统失衡,在一定剂量范围内,细胞抗氧化水平仍处于代偿阶段,细胞存活率与抗氧化能力无显著改变。随着pm2.5染毒剂量增加,ros生成增多,sod、gpx活性显著降低,细胞氧化损伤加重,导致细胞存活率降低,脂质和dna氧化损伤程度加重。n-乙酰半胱氨酸(nac)作为一种抗氧化剂,能够清除已生成的ros,2mm浓度的nac处理能够显著降低pm2.5作用于血管内皮细胞后ros的含量,从而提高pm2.5染毒细胞的存活率(p<0.05),进一步说明ros产生是pm2.5产生细胞毒性的重要因素。rsv干预结果显示,rsv≤20mm时对huvec无明显细胞毒性,10mm浓度的rsv预处理huvec细胞能显著增加pm2.5染毒后细胞的存活率,并显著降低细胞内ros产生,减少pm2.5染毒后mda生成量(p<0.05),westenblot检测结果显示,与单独pm2.5处理组比较,rsv干预组细胞的nrf2核蛋白及sod-2细胞蛋白含量提高(p<0.05)。rsv是一种天然的抗氧化剂,具有心血管保护效应如抗动脉粥样硬化、抗血栓、防治冠心病、抗高血脂等,多项研究表明nrf2通路在调节血管内皮细胞的氧化-抗氧化状态中发挥了重要作用。本实验结果提示,RSV干预能够减少ROS以及MDA的生成,从而减少PM2.5致HUVEC氧化损伤,这可能是RSV对血管内皮细胞保护途径之一,RSV同时对Nrf2核蛋白及其下游抗氧化蛋白SOD-2有一定的调控作用,也揭示了RSV发挥抗氧化功能的机制可能与RSV对Nrf2/SOD-2通路的调控有关,但仍需进一步研究予以明确。结论氧化损伤可能是PM2.5造成心血管损伤的途径之一,随着PM2.5染毒剂量增加,细胞氧化还原状态失衡加重,最终导致细胞内脂质和DNA氧化损伤。RSV干预能够对PM2.5致HUVEC氧化损伤起保护作用,其机制可能与RSV对Nrf2/SOD-2通路的调控有关。