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现己明确持续性高危型人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)感染是宫颈癌发生的主要诱因,其中由HPV16感染引起的宫颈癌占宫颈癌总数的56%。目前尚无有效的宫颈癌治疗性疫苗问世,我国是宫颈癌的高发区,因此研制发针对HPV16的治疗性疫苗意义重大。理想的治疗性疫苗需要全面活化机体的抗瘤免疫,特别是特异性细胞免疫,因此各种免疫刺激分子在肿瘤及病毒治疗性疫苗的研究中倍受重视,特别是在DNA及蛋白疫苗的应用具特别的意义。与活的重组微生物疫苗或灭活疫苗相比,该类疫苗虽然成分单一明确,安全性好,但缺乏刺激产生“危险信号”的能力,活化固有免疫及抗原呈递细胞(Antigen presenting cells,APC)的能力明显不足,因此不利于特异性免疫的有效活化。研究发现不同种属来源的热休克蛋白(Heat shock protein,HSP),如分支结核杆菌来源的HSP(Mycobacterium tuberculosis HSP,MtHSP),鼠源的HSP(Murine heat shock protein,MuHSP),人源的HSP(Human heat shock protein,HuHSP)均具有很强的佐剂活性,可诱发APC细胞分泌前炎性细胞因子,上调DC(Dendritic cells,DC)细胞主要组织相容性复合物(Major histocompatibility complex,MHC)及共刺激分子的表达,促进APC细胞对抗原的摄取,在抗原加工呈递中起伴侣作用,并可将外源性抗原肽交叉呈递给特异性CD8+T,从而利于免疫反应的全面活化,特别是CD8+T细胞的活化。HSP70是热休克蛋白家族的成员之一,具有很强的免疫刺激活性。大量研究表明以HSP70／肽复合物为基础的各种疫苗可显著提高肽特异性的抗肿瘤免疫,该类以HSP70融合抗原为基础的疫苗的大概分为两种情况,一是常规的HSP70融合抗原疫苗,二是近年来出现的HSP70融合抗原前外加外泌信号肽基因修饰的疫苗,如带外泌信号肽HSP70／肽复合物融合基因修饰的瘤细胞疫苗及带外泌信号肽的HPV16E7/HSP70DNA疫苗。研究结果显示带外泌信号肽的HSP／肽复合物疫苗和常规的HSP／肽复合物疫苗一样可以强化特异性的抗肿瘤免疫,目前我们尚未发现有关上述两种形式的HSP／肽复合物疫苗免疫活性的比较研究报道。疫苗的安全性和免疫原性是研发有效疫苗时必须考虑的两个关键性因素,通过引入HSP70免疫佐剂以提高DNA疫苗的免疫原性可望获得免疫原性增强的肿瘤治疗性DNA疫苗,该类疫苗除需考虑常规DNA疫苗的安全性之外,还需兼顾佐剂分子人体应用后可能存在的潜在危险性。小鼠研究发现MtHSP70可诱发机体产生自身免疫性肠炎,进一步研究发现其原因是在体内产生了HSP70的自发反应性T淋巴细胞。对人源及细菌来源的HSP70／肽复合物疫苗免疫活性的比较研究可为相应的人用疫苗的选择提供参考依据。本课题组在前期针对HPV16的治疗性疫苗的研究工作中,联合基因切割重排、定点突变及密码子优化等技术构建获得了消除了转化活性且免疫原性增强的HPV16 E7修饰基因(Modified early gene 7,mE7),以mE7为抗原基因的HPV16治疗性疫苗极具进一步研发的价值,为此我们申请了国家发明专利。为了推动以mE7为基础的HPV16治疗性疫苗的深入研究,本研究拟在本室构建的常规的pVR1012-mE7/MtHSP70研究的基础上,分别构建带外泌信号肽基因的分支结核杆菌来源的和人来源的HSP70融合mE7抗原基因的DNA疫苗pVR1012-SigmE7/MtHSP70和pVR1012-SigmE7/HuHSP70,然后比较分析常规的pVR1012-mE7/MtHSP70和带外泌信号肽基因的pVR1012-SigmE7/MtHSP70DNA疫苗免疫活性的差异,同时对人和分支结核杆菌两种不同种属来源的HSP70／肽复合物DNA疫苗pVR1012-SigmE7/MtHSP70和pVR1012-SigmE7/HuHSP70的免疫活性进行比较研究。实验方法及结果如下：1.pVR1012-SigmE7/MtHSP70和pVR1012-SigmE7/HuHSP70的构建：以pVR1012-mE7重组质粒为模板,将人CD33信号肽基因和mE7基因利用overlap PCR的方法连接在一起,获得N末端带信号肽的不含终止密码子的mE7基因(SigmE’),酶切后将SigmE7基因和MtHSP70基因连接在一起,构建SigmE7/MtHSP70融合基因,然后将该融合基因插入pVR1012真核表达质粒,获得pVR1012-SigmE7/ MtHSP70重组质粒。以含有人HSP70基因的pMSHsp70为模板,利用PCR的方法得到HuHSP70基因,然后将HuHSP70和pVR1012-SigmE7/MtHSP70上的MtHSP70置换,构建了pVR1012-SigmE7/HuHSP70,酶切鉴定和DNA测序验证正确。2.重组质粒的表达鉴定：碱裂解法和聚乙二醇沉淀法大量提取并纯化质粒DNA,脂质体2000介导转染COS-7细胞,48小时后收集裂解液和上清,BCA蛋白定量试剂盒分别对总裂解液和浓缩后的总上清蛋白进行定量,各取1／10体积处理后的裂解液和上清上样,检测转染细胞裂解液和上清中的融合蛋白表达情况。结果表明pVR1012-mE7/MtHSP70、pVR1012-SigmE7/MtHSP70和pVR1012-SigmE7/HuHSP70的裂解液和上清中均发现相应融合蛋白的表达,分子量分别是85,87和100kDa。细胞裂解液中的融合蛋白表达水平明显高于上清中的表达水平,三种融合蛋白在细胞裂解液中的表达水平基本一致,在上清中的表达水平也基本一致。以上结果提示常规的重组质粒也能在胞外表达,而且和带外泌信号肽的重组质粒在胞外的表达水平几乎没有区别,三种融合蛋白的表达以细胞内表达为主。3.动物免疫及疫苗体外免疫活性的检测：将6-8周龄雌性C57BL／6小鼠随机分为四组,每组7只,分别用于pVR1012-mE7/MtHSP70(mE7/MtHSP70)、pVR1012-SigmE7/MtHSP70(SigmE7/MtHSP70)、pVR1012-SigmE7/HuHSP70(SigmE7/ HuHSP70)和生理盐水(Normal saline,NS)肌肉免疫。免疫前预先在每只小鼠的双侧股四头肌内各注射50μl布比卡因,一天后在相同部位注射50μg的质粒DNA,7天后加强免疫1次,最后一次免疫后的第10天,分离小鼠脾细胞,体外经E749-57(2μg/ml)和E730-67肽(2μg／ml)分别刺激后,ELISPOT实验检测分泌IFN-γ的E7特异性CD8+T细胞数目；流式细胞术实验检测E7特异性CD8+T细胞、CD4+／IFN-γ+Thl细胞和CD4+／IL-4+Th2细胞的数目；收集小鼠血清,ELISA法检测免疫血清中E7特异性抗体水平。ELISPOT实验中mE7/MtHSP70,SigmE7/MtHSP70, SigmE7/HuHSP70组和NS对照组中5×105个小鼠脾细胞中平均分泌IFN-γ的CD8+T细胞数目分别为503、100、651和5。流式细胞术实验中四个组CD8+／IFN-γ+双阳性的细胞数目分别是497、389、686和280,CD4+／IFN-γ+双阳性和CD4+／IL-4+双阳性细胞数目分别是385、386、389和383以及165、168、158和150。ELISA实验中1：20滴度时的OD490nm值分别为0.50±0.08、0.56±0.13、0.62±0.15、0.45±0.02。以上结果表明,常规的mE7/MtHSP70比带外泌信号肽的SigmE7/MtHSP70具有更高的CD8+T细胞反应,人源性SigmE7/HuHSP70比结核杆菌源性SigmE7/MtHSP70具有更高的CD8+T细胞反应,三组质粒DNA疫苗几乎没有CD4+／IFN-γ+-Th1细胞和CD4+／IL-4+-Th2细胞介导的CD4+T细胞反应,三组质粒DNA疫苗也都没有显著提高E7特异性的抗体水平。4.疫苗体内抗瘤活性的检测：肿瘤预防实验中,预先按上述方法进行DNA疫苗肌肉免疫,最后一次免疫后的第7天接种7.5×104个HPV16E6／E7的阳性TC-1瘤细胞,接种后的第12天时,SigmE7／MtHSP70组的1只小鼠形成移植瘤,其它两种质粒组未形成移植瘤,NS对照组的7只小鼠形成移植瘤；在接种后的55天时,mE7/MtHSP70组,SigmE7/MtHSP70组和SigmE7/HuHSP70组小鼠的未成瘤率分别是100%,86%和100%。肿瘤治疗实验中,预先接种7.5×104个TC-1细胞,3天后按上述方法进行DNA疫苗免疫。在TC-1瘤细胞接种后的14天,SigmE7/MtHSP70组的1只小鼠形成移植瘤,其它两种质粒组未见移植瘤形成,NS对照组的7只小鼠全部形成移植瘤；接种后的20天,mE7/MtHSP70组的1只小鼠和SigmE7/MtHSP70组的另1只小鼠形成移植瘤,SigmE7/HuHSP70组的小鼠仍未见移植瘤形成；接种后的60天,mE7／MtHSP70组,SigmE7/MtHSP70组和SigmE7/HuHSP70组小鼠的未成瘤率分别是86%,71%和100%。以上结果表明常规的1nE7/MtHSP70比带外泌信号肽的SigmE7/MtHSP70具有更高的抗肿瘤活性,人源性的SigmE7/HuHSP70比结核杆菌源性的SigmE7/MtHSP70展现了更高的抗肿瘤活性。总之,以上结果表明：常规的mE7/MtHSP70DNA疫苗与带外泌信号肽的HSP70相关HPV16mE7DNA疫苗相比可显著提高E7特异性CD8+T细胞反应和抗肿瘤活性；与结核杆菌源性HSP70相比,人源性HSP70在HPV16mE7DNA疫苗中具有更强的免疫佐剂活性；上述各种形式的1nE7/HSP70DNA疫苗的抗瘤活性可能主要是由活化E7特异的CD8+T细胞所诱发的。本研究提示常规的人源性HSP70融合HPV16mE7基因的DNA疫苗可望产生更高效的特异性抗肿瘤免疫,该研究为HPV16感染相关的宫颈癌以及其它已知肿瘤特异或相关抗原的肿瘤治疗性DNA疫苗实验研究打下了基础。