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研究背景纤毛是细胞表面突出的感觉细胞器,其体形微小,结构复杂,具有重要的感官作用,能够感知细胞外界的机械和化学等信号的变化,并且协助信号转导至细胞内部引发相应的细胞应答。最近的研究发现,许多人类疾病都与纤毛的结构和功能紊乱有关;因此,这些疾病统称为“纤毛病(Ciliopathy)”。视网膜中的感光细胞在结构上都包含一个内部节段(Inner Segment,IS)和一个外部节段(Outer Segment,OS),而OS又被称为感光纤毛,它并不表现出通常的纤毛样形态,是人体中修饰度最高和最特殊的感觉纤毛。感光纤毛的缺陷通常会导致疾病的视网膜表型,如视网膜色素变性(RP)、先天性黑矇病(LCA)等。感光细胞的功能是将光刺激转化为生物电信号,从而形成视觉。但过度的光(强度过高或曝光时间过长)则会使其损伤,从而造成视功能的减退,甚至失明。这一因素与视网膜色素变性、年龄相关性黄斑变性(AMD)等视网膜退行性疾病的致病机制相关。聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(Poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)是一种在细胞对DNA损伤反应中发挥重要作用的核酶,其在DNA损伤断裂时被激活,参与DNA修复和转录的功能。但PARP的过度激活则会引起细胞死亡。到目前为止,针对于视网膜纤毛病的研究尚为数不多,对于可归类为“纤毛病”的视网膜退行性疾病也尚未有较好的临床治疗策略,而人们日常对光的接触又不可避免,因此对于保护视觉免受光损伤的需求更显迫切。本研究从纤毛的角度出发,结合细胞及动物实验,在体内外通过模拟视网膜光损伤模型拟研究及探讨抑制PARP对视网膜感光纤毛的保护作用及机制。目的1.通过建立感光细胞(661W)光损伤模型,观察光损伤时细胞内PARP蛋白表达水平的变化,建立PARP敲低细胞系,确定PARP抑制在光损伤时对感光细胞的保护作用;2.通过细胞光损伤模型,对纤毛的结构、数量进行观察,检测细胞内纤毛相关蛋白的表达水平,验证光对纤毛造成的损伤,确定PARP抑制在光损伤时对感光细胞纤毛的保护作用;3.建立小鼠视网膜光损伤模型,对视网膜感光纤毛结构进行观察,检测视网膜纤毛相关蛋白的表达水平,通过体内实验验证光对小鼠视网膜感光纤毛造成的损伤,确定PARP抑制在光损伤时对视网膜感光纤毛的保护作用;4.探讨PARP抑制对感光纤毛的保护作用的分子机制。方法1.PARP抑制在光损伤时对感光细胞的保护作用观察。应用感光细胞(661W)暴露于1500lux白光下建立细胞光损伤模型,采用Western Blot法检测细胞内PARP蛋白表达水平随光照时间变化而变化的趋势。应用sh RNA慢病毒载体技术建立PARP敲低661W细胞系,Western Blot法进行验证。在光损伤条件下采用PI/Hoechst染色法观察各组细胞的死亡率。2.PARP抑制在光损伤时对感光细胞纤毛的保护作用观察。应用透射电镜技术观察光损伤时感光细胞表面的纤毛变化。应用免疫荧光染色法对初级纤毛进行染色且计数有纤毛细胞百分比来量化细胞的纤毛水平。在光损伤情况下比较661W细胞及PARP敲低细胞的有纤毛细胞百分比,以评价PARP抑制对细胞纤毛的保护作用。加之,采用Western Blot法检测细胞内纤毛相关蛋白(CEP164、Arl13b)的表达水平,以评估PARP敲低对感光细胞纤毛的保护作用。3.PARP抑制在光损伤时对视网膜感光纤毛的保护作用观察。应用C57BL/6J小鼠建立体内视网膜光损伤模型,并用PARP抑制剂(ABT-888)建立治疗组,应用视网膜石蜡切片HE染色观察视网膜结构及厚度的变化、应用透射电镜观察视网膜感光纤毛的形态改变。应用免疫荧光染色法观察纤毛相关蛋白(CEP164、Arl13b)在小鼠视网膜的定位情况。应用Western Blot法检测小鼠视网膜内纤毛相关蛋白(CEP164、Arl13b)的表达水平,以评估PARP抑制剂对视网膜感光纤毛的保护作用。4.PARP抑制对感光细胞纤毛的保护作用机制的探讨。应用免疫荧光共定位观察661W细胞及小鼠视网膜内纤毛与p Ser473-Akt的定位关系。在细胞水平,应用Western Blot法检测PARP敲低时PI3K/Akt通路的活化水平,进一步确认PARP抑制与PI3K/Akt通路活化的关系。对PARP敲低细胞应用PI3K抑制剂(LY294002),利用免疫荧光染色量化有纤毛细胞百分比,评价PARP抑制保护作用的变化。另外,对661W细胞应用Akt激活剂(SC79),同样应用免疫荧光染色量化有纤毛细胞百分比,观察其在光损伤情况下对感光细胞纤毛是否发挥保护作用。结果1.661W细胞暴露于光下,随着时间的延长可以观察到PARP蛋白表达水平的升高,当光照时间持续2天时达到最高水平。对细胞进行PARP敲低后,尽管细胞死亡率依然随着光照时间的延长而上升,但PARP敲低细胞系与对照组细胞相比,其细胞的死亡率明显下降,差异具有统计学意义。2.光损伤的661W细胞经透射电镜观察,当光损伤时间持续1天时,细胞表面纤毛数即大量减少,当光损伤持续2天时已很难找到正常的纤毛结构。而当光损伤时间持续1天时,PARP敲低细胞的有纤毛细胞百分比仍然可以维持在较高水平,其纤毛相关蛋白(CEP164、Arl13b)的表达水平较对照组相比也得以维持,差异具有统计学意义。3.光损伤使小鼠视网膜外核层细胞数减少、外核层变薄、感光细胞层变薄、OS段结构肿胀、空泡变性、盘膜结构排列紊乱,而予以PARP抑制剂(ABT-888)治疗的小鼠视网膜形态得到明显的改善。免疫荧光染色显示CEP164在IS层有明显的表达,Arl13b在IS及OS层均有表达。Western Blot检测显示光损伤时小鼠视网膜纤毛相关蛋白(CEP164、Arl13b)的表达水平明显下降,而予以PARP抑制剂治疗的小鼠视网膜纤毛相关蛋白的表达水平得以维持,差异具有统计学意义。4.在感光细胞中,免疫荧光共定位染色显示p Ser473-Akt定位于初级纤毛的基底部,或位于两相邻初级纤毛之间。在小鼠视网膜冰冻切片的免疫荧光染色中显示p Ser473-Akt在IS层有表达。对PARP敲低细胞应用PI3K抑制剂(LY294002)后,当细胞发生光损伤时,PARP抑制对细胞纤毛的保护作用明显减弱,差异具有统计学意义。当对661W细胞应用Akt激活剂(SC79)后,当细胞发生光损伤时,有纤毛细胞百分比得以维持,与对照组相比其差异具有统计学意义。结论1.感光细胞光损伤过程中PARP信号被激活,且PARP的过度活化参与了光损伤导致的感光细胞死亡;2.感光细胞光损伤过程中抑制PARP可以保护视网膜感光纤毛的结构,并且降低感光细胞的死亡率;3.抑制PARP对感光纤毛的保护作用与维持纤毛相关蛋白(CEP164、Arl13b)的表达水平有关;4.抑制PARP对感光纤毛的保护作用与PI3K/Akt通路的激活,从而促进p Ser473-Akt在纤毛基底部或纤毛间的转位有关。