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本研究以龙眼(Dimocarpus longan Lour. cv. Honghezi)“红核子”松散型胚性愈伤组织(Friable embryogenic callus,FEC)为材料进行了研究,内容包括:⑴利用双向凝胶电泳技术分离龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中的蛋白质,通过分析得到相关的差异或特异蛋白点;⑵对分离得到的差异或特异蛋白质点进行质谱鉴定,并对鉴定成功的点进行功能分析;⑶通过研究不同浓度精胺(spermine)、亚精胺(spermidine)、腐胺(putrescine)对龙眼松散型胚性愈伤组织生长状况的影响,来探讨龙眼FEC的生长和衰老机制,为FEC的培养、长期继代以及胚性的保持提供科学依据。研究结果如下:1.龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中总蛋白点数目变化龙眼FEC生长过程中,双向凝胶电泳图谱显示,总蛋白点数在400-800之间,总蛋白点数的变化趋势呈先缓慢上升,再迅速下降,然后迅速上升,最后再平缓上升,虽中间有大幅下降,但总体呈上升趋势,到培养50d时达到最大值。下降的时期是在培养30d时,并且数目变化剧烈。2.龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中总蛋白点等电点(pI)变化龙眼FEC生长过程中,蛋白质等电点主要集中在4-7之间。其中pI在4-5和5-6范围内的蛋白点数目变化趋势相似,都经历了一个先上升再缓慢下降又渐渐回升的变化过程,pI在5-6范围的蛋白点数始终多于pI4-5范围的蛋白数目,pI6-7的蛋白点数基本呈相反变化,在10d-30d缓慢下降,在30d-40d时迅速上升,且超过pI范围5-6的数目,之后又缓慢下降到与其接近的水平。3.龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中总蛋白点分子量(MW)变化龙眼FEC生长过程中,蛋白质的分子量在14 KD -97 KD之间都有分布。而不同分子量范围内的蛋白点变化总体趋势稍有不同,表达量相对较高的是分子量在30KD-45KD和45KD-66KD范围的蛋白质,但是变化趋势完全相反,MW30KD-45KD的变化趋势是先升高,后趋于平稳,MW 45KD-66KD的变化趋势是先下降,后趋于平稳;分子量范围14.4KD-20.1KD和20.1 KD-30 KD的蛋白数目变化趋势基本相似,为先升高再降低再升高;66KD-97KD的大分子量蛋白质,变化趋势不明显,基本持平,后期略有下降。4.龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中15KD小分子量蛋白点数目变化龙眼FEC生长过程中,低于15KD的小分子量蛋白数目在5-20之间,每个阶段小分子量蛋白的比例不超过3%。整个生长过程中小分子量蛋白点数变化呈先降低,后持续升高,到不再变化。小分子量蛋白数目在总蛋白数中占的比例变化趋势基本相似,呈先降低,后持续升高,再略微降低的趋势。比例达到最高峰的时期是培养到40d时,达到2.68%。5.龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中相关蛋白的功能分析龙眼FEC生长过程中质谱鉴定成功的66个点(包括本实验室何园和赖呈纯已鉴定成功的18个点)中除28.79%的功能未知蛋白,在已知功能的蛋白中,30.30%涉及胁迫应答和抗氧化,12.12%涉及能量和糖代谢,9.09%涉及蛋白代谢和修复,6.06%涉及细胞骨架重构,4.55%蛋白是调控蛋白,另外还有1.52%蛋白和信号转导与细胞凋亡相关,1.52%蛋白与氨基酸代谢相关,1.52%蛋白为脂类代谢相关,3.03%是核酸代谢相关蛋白,1.52%蛋白是维生素代谢相关。6.龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中相关蛋白表达变化龙眼松散型胚性愈伤组织生长过程中,胁迫反应/氧化还原相关蛋白(抗坏血酸类过氧化物酶R147、R158和HC21,苄基醚还原酶同系物TH6、谷胱甘肽过氧化酶以及过氧化物酶L26)表达高峰出现在前期10-20d,而过氧化物酶4多在后期40-50d表达;蛋白质合成及修复的相关蛋白,只有蛋白质异形体1在10-30d表达量都很高,其他蛋白的表达高峰出现在前期10-20d之间,能量与糖代谢相关酶在整个过程中都有较大量的表达。后期有与多胺前体合成相关的S-腺苷甲硫氨酸合成酶以及大量过氧化物酶的表达,说明多胺不仅有类似抗氧化酶的功能可以清除活性氧,并且能够提高抗氧化酶的活性。7.多胺对龙眼松散型胚性愈伤组织生长状况的影响鉴于蛋白质组研究中发现多个与多胺相关的酶,与多胺在植物中的合成及抗衰老作用相关,因此进一步研究了添加不同浓度精胺、亚精胺和腐胺等多胺对龙眼FEC的影响。结果发现,后期生长到40d时,各培养基中的龙眼FEC从外观上看几乎已经全部褐变,但是部分培养条件的FEC生长量和细胞活力还在增加,没有降低。生长到40d,spm添加浓度为1mg/L、7mg/L、9mg/L时,龙眼FEC生长量仍有大幅上升,幅度超过对照。spm浓度为3mg/L、5mg/L时,细胞活力继续上升;添加spd浓度为3mg/L和7mg/L的培养基中,龙眼FEC的生长量继续大幅度增长,9mg/L的培养基中的FEC的细胞活力依然有上升趋势;培养基中添加put浓度为9mg/L时,龙眼FEC生长量的上升幅度大于对照,而腐胺对细胞活力的增加没有明显促进作用。