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孕酮(Progesterone,简称P4)是一种甾体类激素,主要由黄体及胎盘产生。雌性动物性周期中孕酮水平呈规律性变化,发情期孕酮水平最低,黄体期孕酮水平较高,妊娠期孕酮水平则一直维持在较高水平上。传统孕酮检测采用放射免疫方法(RIA),但鉴于放射性免疫所需设备昂贵,放射物污染环境,不适宜在生产中推广。本研究根据抗原抗体特异性结合原理制备胶体金试纸条,旨在为猪的早期妊娠诊断提供参考,该试纸条不需要专业人员即可使用,便于在市场推广。本研究通过孕酮人工抗原的合成和单克隆抗体的制备,组装了可以用于猪早孕诊断的胶体金试纸条。1孕酮完全抗原的研制为了合成孕酮完全抗原,用O-羧甲基羟胺法将孕酮(P4)肟化,制备半抗原孕酮-3-(O-羧甲基)肟,采用薄层色谱法(TLC)和质谱法鉴定半抗原结构；用混合酸酐法合成孕酮的完全抗原孕酮-牛血清白蛋白(P-BSA),孕酮-鸡卵清白蛋白(P-OVA).用紫外扫描和SDS-PAGE电泳对人工抗原进行初步鉴定,再用免疫学的方法对人工抗原进行最终鉴定。TLC试验结果显示孕酮的迁移率为0.4,合成物的迁移率为0.2,初步说明肟化成功,有肟化物产生。质谱图最强m/z386.2为孕酮-3-(O-羧甲基)肟的分子离子峰,与其理论分子量387.52基本一致,证明孕酮的衍生化是成功的。紫外全波长扫描的结果显示BSA的最大吸收峰为278nm,而P-BSA的最大吸收峰偏移到255nm,P-BSA的紫外全波长扫描的波形和BSA相比发生了明显的变化；P-OVA的最大吸收峰为255nm,和OVA最大吸收峰278nm相比发生了偏移,P-OVA的波形和OVA相比发生了明显的变化。初步证明孕酮人工抗原的合成是成功的。结合紫外全波长扫描和考马斯亮蓝法估算P-BSA和P-OVA中半抗原与载体蛋白的偶联比率,测得P-BSA的偶联比率为30：1,P-OVA的偶联比率是4：1。用P-BSA免疫新西兰大白兔4次后得到孕酮多克隆抗体,建立间接ELISA和间接竞争ELISA法检测血清抗体效价和抗体竞争抑制率。结果表明,免疫兔血清的效价达到了1：219,兔血清多克隆抗体竞争抑制率(IC50)为207ng/mL之间。最终证明该完全抗原可以刺激动物产生针对孕酮的高效价、高特异性的抗血清,半抗原孕酮-3-(O-羧甲基)肟和人工抗原P-BSA, P-OVA合成成功。2孕酮单克隆抗体的研制为了制备孕酮的单克隆抗体,用人工合成的孕酮-牛血清白蛋白(P-BSA)作为抗原免疫BALB/C小鼠4次后,取其中一只小鼠的脾细胞,在PEG1450作用下与SP2/0细胞融合,与此同时建立检测孕酮抗体的间接ELISA方法。利用杂交瘤技术和ELISA方法筛选得到1株稳定分泌孕酮单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C11。用建立好的间接ELISA方法对其腹水进行效价测定,其效价为1：204800。对这株单抗进行亚型鉴定,结果显示其IgG1的OD450值0.481,Kappa的OD450值0.601,其余的亚型OD450值均小于0.2(OD450≥0.2判为阳性),说明杂交瘤细胞2C11分泌的抗体亚型为IgG1,轻链类型为Kappa。将这株细胞经体外传代和多次冻存复苏后,连续培养5天,其上清OD450均值分别为1.10、1.12、1.11、1.12、1.19,说明2C11抗体分泌稳定。3检测孕酮的胶体金试纸条的研制利用2C11杂交瘤细胞株的腹水单抗制备检测孕酮的胶体金试纸条。采用免疫竞争法,将2C11分泌的单克隆抗体-胶体金复合物包被在胶体金结合垫上,单克隆抗体包被浓度为18μg/mL。同时将人工合成的P-OVA以0.548mg/mL包被在硝酸纤维素薄膜表面作为检测线(T线),将孕酮单克隆抗体的羊抗鼠二抗以0.625mg/mL包被在硝酸纤维素薄膜表面作为质控线(C线)。T线的人工抗原与待检样品中的孕酮竞争结合胶体金标记的孕酮单克隆抗体,通过T线是否显色判断阴阳性。采用该试纸条检测样品,整个检测过程只需10min,检测限可以达到100ng/mL,与睾酮,雌二醇无交叉反应。说明检测试剂具有较高的灵敏度及特异性,操作便捷,稳定可靠,可作为判断母猪是否怀孕的有效检测手段。