研究背景及目的 肿瘤抑制物的研究已经进行了多年。目前已知有多种物质对肿瘤具有抑制作用，除了传统的化疗药物外，肝素和氢化可的松，生长抑素，非甾体类抗炎药物等都对肿瘤有抑制作用；此外也发现某些中药如：斑蟊酸钠、苦参素、华蟾素和川芎素，薏苡仁等有抑制肿瘤的作用。 羟基磷灰石由于其良好的生物相容性，曾被作为骨组织的替代材料，广泛应用于骨缺损修复的临床。Kano等，于1992年通过湿热法制备出羟基磷灰石微晶，不经过烧结而是直接将这种羟基磷灰石微晶制备成羟基磷灰石溶胶（HAP-Sol），其晶体颗粒直径＜100nm。目前，一般认为颗粒直径小于100nm的材料属于纳米材料。最初研制出的HAP-Sol容易发生聚集沉淀，后人对其进行了改进，利用Ca（OH）₂饱和溶液在超声波作用下制备出稳定的HAP-Sol。1996年，武汉理工大学的李世普教授发现HAP-Sol对某些恶性肿瘤细胞具有抑制作用，并进行了初步研究。他先后对W-256癌肉瘤细胞、艾氏腹水瘤细胞、A549肺癌细胞进行试验观察，应用MTT法发现有抑制作用。然而，对于产生这种现象的原因（机制）研究较少，且研究的方法也比较简单，并存在许多疑问：是否是HAP-Sol对细胞培养液的PH产生影响，进而导致细胞死亡?是否存在凋亡?此外，HAP-Sol对人舌癌细胞的作用国内外尚未见有文献报道。故本研究拟采用人舌癌细胞株Tca8113为试验对象，并以成骨细胞和L929成纤维细胞做为对照，通过对增殖活性和凋亡相关因子的检测，研究HAP-Sol 纳米羟基磷灰石溶胶对人舌癌细胞凋亡诱导作用研究 对人舌癌在体内外的特异性作用，并探讨可能机制。 研究方法 纳米羟基磷灰石溶胶（HAP－S。1）以不同浓度加人RPMI 1640培养基中，观察PH值的 改变，利用MTT法选出实验允许浓度，以排除PH的影响。不同浓度的HAP－S。l与人舌癌 Tea81 13细胞体外混合培养干6孔板中，不同时间倒置显微镜观察细胞形态，并以原代培 养的成骨细胞和 L929成纤维细胞为对照；取处理后不同时间的肿瘤细胞，胎盼蓝染色， 细胞计数绘制细胞生长曲线；Berry硝酸铅法进行酸性磷酸酶染色，观察不同浓度，不同时 间处理后的细胞溶酶体活性；肿瘤细胞DNA抽提，琼脂糖凝胶电泳，观察细胞凋亡的梯带 （DNA Ladder）；Hoechst33342荧光染色，观察DNA断裂情况；改良H苯胺法定量测定DNA断 裂百分率；透射电镜不同处理时间后细胞的超微结构变化；以及采用火焰原子吸收法测定 不同条件下肿瘤细胞内钙离子的变化。实验中设立RPMll640为空白对照及普通羟基磷灰 石为阴性对照。体外试验确认有抑制作用后，进行动物体内抑瘤实验：建立裸鼠的Tea8113 移植瘤模型，采用瘤腔直接注射法，注射HAP－SOI，记录注射后不同时间肿瘤的长短径， 计算肿瘤抑制率；实验结束时取肿瘤标本做常规HE切片及Caspase3免疫组织化学染色和 酸性磷酸酶染色，观察组织中肿瘤细胞凋亡情况。 实验结果 70ill的HAP－SOI引起的PH变化对细胞增殖的影响无法忽略，故实验中最高采用剂量 为60ul（每3ml培养液中）。不同浓度的HAP－Sol处理后舌癌细胞增殖受到明显抑制，且 具有剂量依赖性，浓度越高抑制作用越明显，处理时间越长抑制作用也越明显，即具有时 间依赖性；而原代培养的成骨细胞及L929成纤维细胞受影响较小，细胞形态无明显变化， 增殖活性无受抑现象，说明HAP－S＊作用具有肿瘤特异性；普通羟基磷灰石组及空白组没 有发现生长抑制现象；经过HAP－Sd处理后的肿瘤细胞，酸性磷酸酶染色呈阳性，时间越 久、剂量越大染色越明显；实验组肿瘤细胞的DNA琼脂糖凝胶电泳可见“梯状”条带，而 成骨细胞、成纤维细胞以及空白对照组均为单一的一条DNA条带，未见明显“梯子”，同 时实验组的 DNA断裂百分率也随时间和剂量的增大而增高；Hoechst33342荧光染色显示对 照组细胞呈现均匀弥散的荧光，而实验组则为高亮的斑块状荧光；透射电镜下可见实验组 细胞内溶酶体增生，染色质浓聚，核膜邹缩，凋亡小体形成等典型凋亡改变，溶酶体内可 见被吞噬的HAP－S＊颗粒；原子吸收法测定发现实验组细胞内钙离子浓度与处理后一天明 3 浙江大学硕士毕业论文2003年 显增高，其后缓慢下降，与对照组相比较有统计学意义。裸鼠移植瘤实验证明，HAP－SOI 直接注射具有肿瘤抑制作用，与剂量成正相关；肿瘤标本HE切片上可见大片坏死及可疑 凋亡细胞，凋亡／死亡细胞均围绕?