抗菌肽（Amphibian antimicrobial peptides,AMPs）是由生物体产生的且具有一定抗细菌、抗微生物、抗寄生虫以及抗肿瘤的小分子抗肿瘤肽类物质。RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp）的短肽,作为肿瘤细胞和新生血管特异性表达整合素的相互作用的识别位点,成为肿瘤治疗新的靶点。此外,与RGD偶联的抗肿瘤肽可以诱导肿瘤细胞凋亡并且作为载体在肿瘤靶向治疗中发挥重要作用。本实验室前期从牛蛙皮肤c DNA文库中筛选的Temporin-La（T-La）抗肿瘤肽为基序,通过生物信息学设计新型抗肿瘤肽T-La（S）与T-La（FS）,并将其与RGD肽偶联成RGD-T-La（S）和RGD-T-La（FS）,前期试验证明新牛蛙抗肿瘤肽T-La（S）,T-La（FS）以及RGD-嵌合体肽RGD-T-La（S）和RGD-T-La（FS）对B16F10细胞的体内外增殖有显著的抑制作用。因此,在前期的研究基础上,进一步研究改造后的抗肿瘤肽及RGD-嵌合体肽对小鼠黑色素瘤B16F10细胞增殖及凋亡的机制。通过体外培养小鼠黑色素瘤B16F10细胞,根据不同的处理方法分为T-La（S）、R GD-T-La（S）、T-La（FS）、RGD-T-La（FS）以及空白对照组,在不同浓度和时间下,通过CCK-8试验和乳酸脱氢酶的测定检测抗肿瘤肽对B16F10细胞的抑制活性;通过流式细胞仪检测不同浓度的抗肿瘤肽对B16F10细胞周期、线粒体活性氧以及线粒体膜电位的影响;通过Western blotting和q-PCR检测抗肿瘤肽对B16F10细胞凋亡相关蛋白（Caspase-3、Bcl-2、Bax、Caspase-9）以及凋亡相关基因m RNA转录水平的影响;通过细胞划痕及细胞Transwell侵袭试验检测抗肿瘤肽对B16F10细胞迁移及侵袭的影响;通过Na OH裂解法和L-Dopa氧化法测定抗肿瘤肽对B16F10细胞黑色素含量及酪氨酸酶活性的影响,通过q-PCR检测抗肿瘤肽对B16F10细胞小眼转录因子（MITF）和酪氨酸酶（TYR）m RNA转录水平的影响;通过Western blotting和q-PCR检测抗肿瘤肽对B16F10细胞自噬相关蛋白（LC3B、Beclin 1）以及自噬调控基因（Atg 5、Atg 7、Atg 12）m RNA转录水平的影响;Western blotting方法检测抗肿瘤肽对B16F10细胞自噬相关通路PI3K/m TOR/AKT的影响。构建BALB/c裸小鼠荷B16F10细胞肿瘤模型,检测抗肿瘤肽对小鼠体内细胞因子IL-3、IFN-α水平的影响,综合评价RGD-嵌合体肽对黑色素瘤的治疗效果。结果表明,4种抗肿瘤肽能够显著抑制B16F10细胞增殖,RGD-T-La（S）和RGD-T-La（FS）在200μg/m L时B16F10细胞的存活率仅为13%和16%;4种抗肿瘤肽肽能够显著增加B16F10细胞中LDH含量,RGD-T-La（S）和RGD-T-La（FS）在100μg/m L时B16F10中乳酸脱氢酶含量分别为340.9 U/L和225.8 U/L;与对照组相比,四种抗肿瘤肽均可引起B16F10细胞G0/G1期阻滞,其中RGD-T-La（FS）组还可引起B16F10细胞S期阻滞,在20μg/m L时S期细胞比例达到（54.97±0.38）%;四种抗肿瘤肽均可引起细胞内活性氧水平显著升高和线粒体膜电位显著或极显著下降,且呈浓度依赖性。与对照组相比,四种抗肿瘤肽在20、50μg/m L作用B16F10细胞后,均能显著抑制B16F10细胞的侵袭与转移,且呈时间-浓度依赖性;抗肿瘤肽对酪氨酸酶活性和细胞黑色素的生成具有明显的抑制作用,显著降低酪氨酸酶（TYR）和小眼相关转录因子（MITF）基因表达;抗肿瘤肽作用于B16F10细胞后,促凋亡蛋白Bax,Casp ase-3和Caspase-9表达上调,而抑调亡相关基因Bcl-2明显下调,并与相关凋亡基因m RNA转录水平呈正相关;RGD-嵌合肽能在低浓度（10,20μg/ml）下上调B16F10细胞LC3Ⅱ和Beclin1的表达,调节Atg5、Atg7和Atg12的表达,降低B16F10细胞p-PI3K、p-AKT和p-m TOR的表达,但对PI3K、AKT和m TOR总蛋白的表达无明显影响。RGD-嵌合肽（RGD-T-La（FS））能够显著抑制小鼠黑色素瘤的生长和肺转移,并显著增加小鼠细胞内IFN-α的含量。RGD-嵌合体肽体内和体外具有抑制B16F10细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用,能够促进抗肿瘤肽T-La（FS）对肿瘤细胞的靶向杀伤作用。旨在为研究RGD-嵌合体肽RGD-T-La（S）和RGD-T-La（FS）靶向抗肿瘤的作用机制以及为临床相关抗肿瘤药物的研发提供科学依据。