原发性肝癌（primary hepatocellular carcinoma,PHCC）已成为我国癌症死亡的第二大原因。肝癌形成的过程有一定的规律,其发生发展是多因素、多基因、多阶段的复杂过程:病毒感染人体后潜伏状态—急性发病—慢性过程—肝纤维化—肝硬化—肝癌。血清组分变化可充分反映机体生理、病理过程,容易获取并易于监测,故一直是筛选疾病诊断标记物的最佳研究对象。虽然目前常用的肝癌血清标记物主要为甲胎蛋白、异常凝血酶原及一些酶类,但特异性和敏感性不能满足临床需求。为此,筛选在肝癌发病阶段关键差异蛋白仍然十分必要。糖基化是最常见的蛋白质修饰,在恶性肿瘤中,大约50%以上的蛋白质都有糖基化发生。分析疾病相关的蛋白质糖基化改变,在探求疾病诊疗策略和发现诊断标志物方面扮演着越来越重要的角色。许多疾病的发生与蛋白质糖链结构异常有关,至今仍没有系统的糖蛋白修饰谱的异常糖基化蛋白质。由于a-1,6岩藻糖（又称核心岩藻糖）普遍存在于许多糖蛋白中,并且其糖基化程度异常与肝癌或慢性肝病的发生和诊断关系密切。针对上述疾病各个阶段动态变化的特点,本课题拟尝试蛋白质组学中双向电泳-质谱技术（2-DE-MS）分别筛选肝癌发生发展各个阶段过程中血清中肿瘤标记蛋白,对筛选出的潜在肝癌血清标记物进行下一步的验证。同时应用MP技术双向电泳（2-DE）并进行复合染色,然后应用免疫沉淀和多种凝集素印迹。运用前一种方法,获得了肝癌、肝硬化、慢性肝炎和正常健康者血清糖蛋白质修饰谱;运用后一种方法对上述肝癌发生发展过程中的各个疾病阶段进行研究,发现HP-β链异常核心岩藻糖基化状态及差异性表达,分析HP-β链的糖链结构的改变与肝癌发生发展过程中的关系。总之,HP-β链的蛋白表达水平和N-糖链结构的改变与肝癌发生发展过程中的关系。第一部分人血清蛋白质组研究方法的比较和优化目的:优化血清蛋白质组双向电泳（2-DE）技术,建立适合本实验的技术方法。方法:用健康人血清样本,通过改进样品制备,包括高丰度蛋白的去除,对传统的双向凝胶电泳技术的程序及有关环节进行改进,如等电聚焦程序、溶胀液成分和凝胶染色方法（考马斯亮蓝R-250染色和SYPRO-Ruby荧光染色）进行了一系列的比较和优化,提高2-DE对血清蛋白的分辨能力。结果:获得了较为理想的电泳图谱:考马斯亮蓝染色和SYPRO-Ruby荧光染色相比,血清2-DE图谱共检测到平均蛋白质点数分别是324±25（n=3）和785±30（n=3）;去除高丰度蛋白前后,未做处理的血清、去除蛋白和IgG血清的2-DE图谱共检测到平均蛋白点数分别是501±25（n=3）和813±22（n=3）;图谱分辨率得到明显的提高,水平条带及纵向拖尾现象明显减少。同时,2-DE的重复性也有大幅度提高:同组样品在三次不同实验中所得蛋白质斑点数目分别为782、728和800个。去除高丰度蛋白并结合SYPRO-Ruby荧光染色可以大大提高血清低丰度的解析能力。结论:建立并优化了血清蛋白质2-DE技术,为进一步开展疾病血清蛋白组学研究奠定基础。第二部分肝癌发生发展不同阶段血清蛋白质组的比较研究目的:利用血清蛋白质组学方法,建立分辨率高和重复性好的血清蛋白质的双向凝胶电泳图谱,从而在肝癌动态发展过程中寻找差异蛋白,探讨其变化发展的规律。方法:收集血清,除人肝硬化组10例外,其余正常人血清组、慢性迁延性肝炎组和肝癌组均20例以上;对样本进行超声,去除白、球蛋白并除盐浓缩,然后应用双向凝胶电泳分离四组血清蛋白,经SYPRO-Ruby荧光染色、图像扫描和软件分析,Gelpix快速蛋白切胶仪切割差异大于或等于两倍以上的蛋白点,运用基质辅助激光解析飞行时间质谱对差异点进行鉴定。结果:通过样品预处理,白蛋白和免疫球蛋白的去除,参考胶点数由处理前的513个增至853个。四组血清的双向电泳图谱经Image master 6.0软件匹配分析,各组检测到的蛋白点数如下（均为n=3）:正常组784±39个,肝炎组825±29个,肝硬化组755±37个,肝癌组850±10个。分别以两个实验组的组内2-DE效果好、点数多的一块胶作为参考胶,进行组内的匹配分析,四组共筛选出差异2倍及以上且出现频率大于或等于50%的蛋白点96个,成功鉴定出25种差异蛋白,取正常组绝对量为1,换算其他各组各个点的量,发现这样几组变化规律:①正常→肝炎→肝硬化持续下调,到肝癌上调,这类蛋白共有12种,主要见于Hp、hp2-alpha、preprohaptoglobin、SP40等;②正常→肝炎→肝硬化持续上调,到肝癌下调,这类蛋白共有2种,见于Ig muheavy chain disease protein、Immunoglobulin J chain;③正常→肝炎上调,到肝硬化下调,到肝癌又上调,这类蛋白共有4种,主要见于Chain A,Human Serum Transferrin、similar co human albumin;④肝炎→肝硬化（肝癌）上调,这个蛋白是unnamed protein product。在这30个差异的蛋白点中,有7个蛋白点均为一种蛋白-结合珠蛋白（haptoglobin）家族,并且在四组中变化模式最显著,均是由正常→肝炎→肝硬化持续下调,到肝癌又上调。结论:高丰度蛋白的去除,获得了重复性较好的双向凝胶电泳图谱;发现了与肝癌发生发展相关的差异蛋白分子,揭示了在肝癌发生发展的动态过程中几种明显变化模式,可能为肝癌的早期诊断和预后提供依据;haptoglobin蛋白很可能是肝硬化阶段发展到肝癌的一个潜在早期诊断标志物。第三部分差异蛋白HP家族的表达验证及其N-聚糖的特征探索目的:对HP进一步的表达验证,推测HP N-糖链结构。方法:收集正常人组、慢性迁延性肝炎组、肝硬化组和肝癌组血清均30例,,通过免疫比浊法测定HP的蛋白含量;每组另外再取13例样本,用免疫印迹验证各组结合珠蛋白的蛋白表达水平。分别再利用双向电泳与Pro-Q Emerald 488糖蛋白染料和SYPRO Ruby相结合的复合蛋白质组学（MP）技术,进一步研究HP这一类糖蛋白,利用Image master6.0软件计算各自的蛋白灰度vol%值;应用抗体免疫沉淀纯化HP一类糖蛋白,并应用western blot辅以几种常见的凝集素印迹,验证HP一类蛋白的凝集素结合特性,并推断其可能的糖链结构特征。结果:免疫比浊法测haptoglobin的总含量（包括α和β链）变化趋势同2D结果一致。13例免疫印迹验证结合珠蛋白的β链表达同2D结果大致相同,均是正常组结合珠蛋白总含量多于慢性迁延性肝炎组,又多于肝硬化组,但肝硬化组结合珠蛋白总含量少于肝癌组。488糖蛋白染色和SYPRO Ruby总蛋白染色比对,发现结合珠蛋白α₂-HP和haptoglobin的蛋白质表达水平的变化与其糖基化程度的变化一致,preprohaptoglobin的蛋白表达水平变化与其糖基化程度的变化不相一致;HP多抗抗体免疫沉淀纯化HP-β链,不同的凝集素亲和印迹法对HP-β链进行糖链结构推断,HP-β链在LC和HCC中对AAL和LCA的亲和力较强,其中在HCC组对AAL和LCA的亲和力比肝硬化组高,PHA-E和RCA-Ⅰ对HCC的亲和力高,以上几种凝集素在正常和肝炎中几乎无亲和力,DSA和Con A在四组样本中均无亲和力;结论:验证了HP一类蛋白在正常、慢性迁延性肝炎、肝硬化和肝癌中蛋白表达水平。推测haptoglobin-β链在人不同血清样本中糖修饰谱的结构变化,它们也可能是影响肝癌发生发展进程中的一个重要因素。结合珠蛋白含有末端、核心岩藻糖型和及末端半乳糖型糖链结构形式,在癌变的发生发展过程中伴随着haptoglobin的核心和末端岩藻糖型糖基化程度增加。结论1.通过血清样品预处理,进行染色方法的比较等措施,优化蛋白质组学技术平台。2.应用建立2-DE技术平台,在肝癌、肝硬化、慢性迁延性肝炎和正常四组血清样本中鉴定了25种差异蛋白,并且总结了四种主要的蛋白变化模式。结合珠蛋白家族为变化最显著的一类蛋白。3.通过对HP的表达验证,我们推测结合珠蛋白家族可作为肝癌的潜在血清标记物,特别是肝硬化到肝癌阶段,值得进一步研究。4.应用MP技术结合2-DE显示血清糖蛋白表达谱,免疫沉淀和凝集素印迹研究结合珠蛋白N-糖基化修饰,推测其糖链结构除异常核心岩藻糖基化外,其他糖链结构改变也与肝癌发生发展相关。创新点1.首次报道结合珠蛋白作为肝癌的潜在血清标记物,尤其是肝硬化到肝癌阶段。2.应用血清蛋白质组学技术,国内首次研究肝癌发生发展过程中不同疾病状态蛋白变化,并鉴定出25种差异蛋白,总结四种蛋白变化模式。3.首次对肝癌发生、发展不同疾病状态下的HP进行糖基化修饰谱的研究,对N-糖链结构的分析有重要价值。潜在应用价值1.运用血清蛋白质组学技术建立双向电泳图谱数据库,其作为筛选疾病血清标记物的有力工具,将有助于大量新的疾病血清标记物的发现。2.结合珠蛋白作为肝癌的潜在血清标记物,可能成为肝硬化到肝癌阶段的早期诊断标志。对结合珠蛋白这一类蛋白的N-糖链结构的推断,特别是异常岩藻糖基化改变,将有助于研究肝病各阶段血清中的糖基化修饰谱。