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研究目的:初步研究ESRP1在肺腺癌细胞EMT过程中的作用及调控机制,阐明ESRP1基因及蛋白在肺腺癌侵袭转移中的作用,为今后的深入研究奠定基础。研究方法:1.用转化生长因子TGF-β1诱导肺腺癌细胞系A549和H1299发生EMT过程,用Western Blotting检测相关标志物如E-cadherin、N-cadherin的表达情况;同时检测不同时间点转录因子Snail、Twist和ZEB1及ESRP1蛋白的表达情况;通过聚合酶链式反应方法检测ESRP1和ZEB1的基因表达情况。2.构建ZEB1真核表达质粒,分别转染进肺腺癌细胞系A549和H1299,分两组:实验组(ZEB1 vector)和对照组(control vector),用Western Blotting检测ZEB1高表达对ESRP1蛋白表达的变化;用慢病毒si-ZEB1组和si-control组分别感染常规培养的肺腺癌细胞系A549和H1299,分两组:实验组(si-ZEB1)和对照组(si-control),通过Western Blotting检测低表达ZEB1蛋白对ESRP1表达的影响。3.应用聚合酶链式反应方法检测肺腺癌患者原发部位和转移部位ZEB1和ESRP1的基因表达水平的变化。4.通过建立ESRP1的报告基因载体p GL4.17-ESRP1,然后在肺腺癌细胞系A549和H1299中分别按不同分组情况转染进重组质粒p GL4.17-ESRP1和pc DNA3.1/myc-His-ZEB1以及内参(海肾质粒),分析在不同处理情况下启动子的荧光素酶活性。用转化生长因子TGF-β1诱导常规培养的肺腺癌细胞A549和H1299,通过染色质免疫共沉淀的方法(CHIP)验证ZEB1对ESRP1的调控作用。5.将常规培养的肺腺癌细胞系A549和H1299分别用慢病毒载体构建的小RNA(si-RNA)进行转染,设立:实验组(si-ESRP1)和对照组(si-control),我们采用Transwell的实验方法检测ESRP1降表达后对肺腺癌细胞侵袭能力的影响。6.将常规培养的肺腺癌细胞系A549和H1299分别转染ESRP1质粒(ESRP1vector)和空白质粒(control vector),我们采用Transwell的方法检测ESRP1基因及蛋白高表达后对肺腺癌细胞侵袭能力的影响。7.应用RT-PCR检测在转化生长因子TGF-β1诱导肺腺癌细胞系A549和H1299发生EMT过程中,ESRP1基因与CD44基因的变化情况;将ESRP1真核表达载体,分别转染进肺腺癌细胞系A549和H1299,分两组:实验组(ESRP1vector)和对照组(control vector),用RT-PCR检测ESRP1高表达对CD44基因表达的变化;用慢病毒si-ESRP1组和si-control组分别感染常规培养的肺腺癌细胞系A549和H1299,分两组:实验组(si-ESRP1)和对照组(si-control),通过RT-PCR检测降表达ESRP1基因对CD44基因表达的影响;用Transwell的方法检测CD44s基因高表达后对肺腺癌细胞侵袭能力的影响。8.用慢病毒si-ESRP1组和si-control组分别感染常规培养的肺腺癌细胞系A549和H1299,用嘌呤霉素筛选出稳定细胞株,Western Blotting试验验证沉默效果,第一种处理方式:分别将实验组(si-ESRP1)和对照组(si-control)细胞接种于裸鼠皮下,规律观察皮下肿物大小及裸鼠体重并记录;第二种处理方式:分别从裸鼠尾静脉将实验组(si-ESRP1)和对照组(si-control)细胞注射进裸鼠体内,规律观察裸鼠状态及体重并记录,四周后,取出裸鼠肝脏,固定,包埋,制成石蜡标本,HE染色观察。研究结果:1.经转化生长因子TGF-β1(5ng/ml)刺激后,肺腺癌细胞系A549和H1299发生EMT,E-cadherin表达减少,N-cadherin表达增加;随着时间延长,转录因子Snail、Twist和ZEB1表达逐渐增加,ESRP1蛋白表达减少,其中ZEB1和ESRP1表达发生变化的时间点存在一致性。2.和对照组(control vector)相比,实验组(ZEB1 vector)ZEB1蛋白的表达增多,ESRP1蛋白的表达减少;和对照组(si-control)相比,实验组(si-ZEB1)ZEB1蛋白的表达受到明显抑制,而ESRP1蛋白的表达明显增多。3.ESRP1基因的表达水平在肺腺癌患者的转移部位的组织中较原发部位的组织中降低,而ZEB1基因的表达水平与原发部位组织的表达水平相比升高。4.荧光素酶实验:阴性对照组ESRP1启动子相对荧光素酶活性为0.49±0.038μm(A549)和0.75±0.106μm(H1299),实验组为0.32±0.063μm(A549)和0.61±0.118μm(H1299),阴性组为0.21±0.030μm(A549)和0.52±0.078μm(H1299)。染色质免疫共沉淀实验:ESRP1的E-boxes的引物能够使Input组、阳性对照组和处理组扩增,而阴性对照组和空白组无产物;ESRP1的Intergenic的引物扩增结果无意义。5.侵袭实验表明:与对照组相比,ESRP1沉默后穿膜细胞数目明显增多(P<0.05)。6.侵袭实验表明:与对照组相比,ESRP1高表达后穿膜细胞数目略有减少,但无统计学意义;用转化生长因子TGF-β1(5ng/ml)刺激细胞后转染高表达载体(ESRP1 vector),穿膜细胞数目明显减少(P<0.05)。7.皮下接种组:与对照组相比,实验组裸鼠的皮下肿物体积较大(P<0.05);尾静脉注射组:与对照组相比,实验组裸鼠的肝脏转移节点较多(P<0.05)。8.ESRP1可以调节下游靶基因CD44,使CD44s亚型产生增加,促进肺腺癌细胞的侵袭转移。研究结论:EMT过程中转录因子ZEB1可能通过结合ESRP1的启动子调节其转录活性;ESRP1蛋白的低表达与肺腺癌的侵袭转移过程密切相关。