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鸡球虫病是一种病原寄生在细胞内的原虫疾病,给养禽业所带来的经济损失极为严重。实践证明,激发宿主细胞免疫反应来防治鸡球虫病是更有效的途径之一。DNA疫苗的一个显著优势是刺激机体产生广泛的细胞免疫反应和持久的免疫记忆,尤其是联合应用一些细胞因子,构建调节型DNA疫苗,更有诱人的应用前景。为此我们选择球虫的表面抗原以及特定的细胞因子基因,通过DNA重组技术将几种目的基因串联为一体,插入到相关真核表达载体当中,并检测它们对鸡抵抗球虫攻击的免疫保护作用。 用RT-PCR的方法,从感染柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)第5天的鸡盲肠分离的第二代裂殖子中克隆出MZ5-7基因,并进行抗原表位分析和原核表达。结果表明,MZ5-7基因ORF为945bp,与GenBank里已知序列(登录号为L08257)比较,核甘酸和氨基酸同源性均为99.9%。应用DNAStar软件对该基因的抗原表位进行了分析,发现其B细胞表位广泛分布在80-300区域,其中80-120区域、200-220区域和300以后的区域更为突出,T细胞表位则位于123-190区域和220-300区域。根据MZ5-7基因序列设计另外一对引物,PCR方法扩增出不含信号肽、长度为885bp的部分基因序列,克隆到pET28b获得重组质粒pET28b-MZ,转入宿主菌BL21中,用IPTG进行诱导表达,表达的融合蛋白约36.5kD,符合目的蛋白大小;同时应用抗第二代裂殖子和子孢子的高免血清进行western blot检测,结果重组蛋白能够被2种高免血清识别,表明虫体裂殖子和子孢子阶段均表达天然的MZP。 应用RT-PCR方法,分别以ConA体外刺激培养12h、24h、48h的鸡脾脏淋巴细胞(SPL_s)和经人工感染2次柔嫩艾美尔球虫(Eimeria tenella)孢子化卵囊(约3.6×10~4个/鸡)的鸡盲肠扁桃体/肠上皮淋巴细胞(IEL_S)总RNA为模板,均成功的扩增出预计大小的鸡白介素-17cDNA基因,并克隆入pMD18-T载体,进行测序。测序结果显示其阅读框(ORF)为507bp,与GenBank上鸡IL-17基因已知序列(AJ493595)BLAST的结果表明,核苷酸和氨基酸的同源性分别为99.4%和82.4%。将cDNA基因克隆入pET-32a载体中,成功构建了pET32a-IL-17原核表达载体,IPTG