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为了便于对扩展青霉脂肪酶基因进行分子设计及改造，本论文将扩展青霉脂肪酶成熟肽编码基因插入到pPIC9K表达载体中，构建重组表达质粒pPIC9K-pel，并在脂肪酶基因5’端上游加上（His）6标签的编码序列。通过比对扩展青霉脂肪酶与黑曲霉阿魏酸酯酶的氨基酸序列，选择扩展青霉脂肪酶“盖子”左右侧铰链区的第66、81、94位氨基酸、整个“盖子”以及“盖子”右侧铰链区等五个部位作为突变位点，研究扩展青霉脂肪酶“盖子”结构及其两侧铰链区突变对脂肪酶活性的影响。
利用前面构建的重组表达质粒pPIC9K-pel作为模板，采用环状质粒一步PCR定点突变法对扩展青霉脂肪酶“盖子”左右两侧铰链区的三个氨基酸残基进行突变（T66G、T81P、K94E），获得含有突变氨基酸残基编码序列的重组表达质粒，依次为：pPIC9K-pel-T66G、pPIC9K-pel-T81P、pPIC9K-pel-K94E。上述重组表达质粒导入到毕赤酵母GS115营养缺陷型菌株，甲醇诱导表达。表达产物经过Ni-柱亲和纯化后，测定其水解4-硝基苯癸月桂酸酯的比活力。实验结果表明：PELT66G重组脂肪酶的比活力与野生型PEL脂肪酶相近，为5.09 U/mg：而PELT81P和PEIK94E重组脂肪酶的比活力比野生型脂肪酶分别提高了2.95倍和2.57倍，分别达到19.1U/mg和17.2 U/mg。
其次采用引入酶切位点再环状质粒回复突变法置换了扩展青霉脂肪酶的“盖子”结构域（68ITDFVND175-71DTNLOLDT78），并与毕赤酵母表达载体pPIC9K构建成重组表达质粒，命名为pPIC9K-pel（-lid）；该重组质粒导入到毕赤酵母GS115营养缺陷型菌株，甲醇诱导表达。表达产物经Ni-柱纯化后，SDS-PAGE电泳能检测到一条约28 kDa的表达条带。表达产物经橄榄油罗丹明B平板定性检测没有酶活。
最后通过重叠延伸PCR置换了扩展青霉脂肪酶的“盖子”右侧铰链区（76DIA78-79NYT81），突变体插入到载体pPIC9K构建成重组表达质粒，命名为pPIC9K-pel-76DIA78-79NYT81。该重组质粒导入到毕赤酵母GS115营养缺陷型菌株，甲醇诱导表达。表达产物经橄榄油罗丹明B平板定性检测没有酶活。
上述实验结果表明：扩展青霉脂肪酶的“盖子”结构域对其活性有着极为重要的影响，其中“盖子”、“盖子”右侧铰链区以及T81P和K94E的突变表现得尤为明显，这些位置的突变，导致脂肪酶活性完全丧失或者整倍地提高。