论文部分内容阅读
内生真菌在植物抗生物和非生物胁迫中发挥着重要的作用,目前国内外对内生真菌的多样性、生态分布以及生态功能等方面的研究较多,而对内生真菌在植物中侵染定殖规律的报道较少。本研究以前期筛选的枸杞高活性拮抗内生真菌Fusarium nematophilum NQ8GII4为材料,通过单因素试验和响应面法优化NQ8GII4菌株原生质体制备条件;利用PEG介导原生质体转化法,构建GFP标记的NQ8GII4菌株遗传转化体系;通过表型、拮抗活性、致病性、荧光强度以及PCR检测,筛选与野生型相当的转化子;在此基础上,利用GFP标记的NQ8GII4转化子发酵液灌根处理枸杞植株,明确NQ8GII4菌株在枸杞中的定殖情况及对枸杞促生抗病的影响。研究结果如下:1、通过单因素试验考察菌龄(12～20 h)、酶解时间(0.5～3 h)、酶质量浓度(15～35 g/L崩溃酶+10 g/L溶壁酶)、稳渗剂浓度(0.6～1.2 mol/L NaCl)等4个因素对NQ8GII4菌株原生质体产量、再生率和有效原生质体量的影响。采用3因素3水平的Box-Behnken响应面试验优化原生质体制备和再生条件。结果表明,确定酶解时间,酶质量浓度,稳渗剂浓度3因素对原生质体产量、原生质体再生率和有效原生质体量的组合效应。NQ8GII4菌株原生质体制备的最佳条件为:过滤收集菌龄16 h的菌丝0.05 g于1mL质量浓度为30.30 g/L崩溃酶+10 g/L溶壁酶的酶解液中反应2.5h;以0.713 mol/LNaCl为稳渗剂,原生质体产量平均为7.12×1 07个/mL,再生率平均为5.56%,有效原生质体量平均为39.59×105个/mL,与模型预测值拟合较好。2、筛选适合枸杞内生真菌NQ8GII4菌株GFP标签蛋白的表达载体。采用PEG介导原生质体转化法分别将GFP标签蛋白表达载体pFL2、pDL2、r-KNT和KNTG转入NQ8GII4菌株。通过对比4种NQ8GII4转化子的荧光强度、遗传稳定性、拮抗活性和致病性,筛选NQ8GII4菌株GFP标签蛋白的最佳表达载体。枸杞内生真菌NQ8GII4菌株对潮霉素B(HmB)的耐受浓度为20 mg/L,对遗传霉素(G418)的耐受浓度为80 mg/L。通过PEG介导原生质体转化,获得pFL2转化子272株,pDL2转化子57株,r-KNT转化子73株和KNTG转化子226株,转化效率分别为13.6,2.85,3.65和11.3株/μg。荧光显微观察发现,表达载体pDL2和KNTG的转化子所产生的荧光强度明显强于表达载体r-KNT和pFL2的转化子。转化子连续培养5代,pDL2转化子有89.47%可以稳定遗传,pFL2、r-KNT和KNTG转化子的遗传稳定率仅为67.28%,68.49%和58.85%。4种转化子对枸杞胶孢炭疽菌C.gloeosporioides的拮抗活性以及对枸杞叶片的致病性与野生型无明显差异。表达载体pDL2更适合NQ8GII4菌株的GFP标记。3、通过酶解NQ8GII4菌株幼嫩菌丝的细胞壁产生原生质体,PEG8000介导外源DNA随机插入的办法,获得转化子。对pDL2转化子菌落形态、产孢量、生长速率、荧光产生情况、遗传稳定性、拮抗性、致病性、活性氧耐受性进行分析,筛选出与野生型无差异的转化子。结果表明:通过PEG介导原生质体转化获得了57株pDL2转化子,转化效率为2.85个/μg。通过测定生长速率和产孢量,筛选出12株与野生型无差异的菌株。通过荧光观察和PCR检测说明gfp基因已经成功整合到NQ8GII4菌株基因组中,且具有良好的遗传稳定性。通过菌落形态观察和荧光显微观察,转化子的菌落形态、菌丝、孢子、产孢器等与野生型无差异,且所有转化子均可产生绿色荧光,但是荧光强度有差异。通过对枸杞炭疽病菌的拮抗性试验,筛选出1株与野生型无明显差异的菌株NQ-D-47。经过致病性和活性氧平板测定,与野生型无差异。4、为了研究枸杞内生真菌NQ8GII4菌株在枸杞中的定殖情况及对枸杞促生抗病的影响。本研究利用GFP标记的NQ8GII4菌株(NQ-D-47)为材料,对枸杞植株进行灌根处理,在荧光显微镜下观察NQ-D-47菌株在枸杞中的定殖情况,同时检测了不同处理浓度灌根对枸杞植株生长指标和抗病性的影响。结果表明:NQ-D-47菌株能够在枸杞根部定殖,使用10%发酵液进行灌根处理,定殖率达到最大,为93.95%。5%～20%的NQ-D-47菌株发酵液均能促进枸杞植株的生长和根的发育。其中使用5%发酵液灌根,对株高和茎叶重的促进作用最大,相对于对照分别增加了 79.68%和100%;使用10%发酵液灌根,对根重和干物质积累量的促进作用最大,相对于对照分别增加了 195.56%和85.19%。菌株NQ-D-47在枸杞根部的定殖能诱导枸杞植株中PPO、PAL、POD、SOD 4种防御酶活性的提高,提高了枸杞对枸杞炭疽病的抗性。使用10%发酵液进行灌根能够显著的提高枸杞中POD、PAL、PPO、SOD 4种防御酶的活性,增强枸杞对枸杞炭疽病的抗性,枸杞发病率仅为6.7%,明显低于未经NQ-D-47灌根处理的枸杞炭疽病菌的发病率(100%),防效高达93.33%。