论文部分内容阅读
实验一两血管结扎术建立血管性认知障碍大鼠模型及益神方对血管性认知障碍模型大鼠的行为学影响目的:通过改良-两血管结扎(2-VO)法作为血管性认知障碍大鼠模型造模方法,并观察造模后对大鼠认知行为功能的影响,并探讨益神方的治疗是否有效改善血管性认知障碍大鼠的学习记忆能力。方法:1.实验分组:正式实验前筛查排除视物不清及游泳障碍的大鼠,运用随机数字表法将大鼠随机分为5组:假手术(sham组),模型2周组(M2w组),模型4周组(M4w组),模型6周组(M6w组),中药组(ZY组)。2.造模方法:改良-两血管结扎(2-VO)作为血管性认知障碍大鼠模型造模方法,假手术组分离双侧颈总动脉后不进行结扎。3.给药方法:中药组给予益神方中药药液灌胃,其余组给予相同比重的纯净水,连续6周。4.行为学检测:假手术组,模型6周组及中药组分别于造模后的1周以及灌胃治疗6周后使用Morris水迷宫进行学习记忆行为测试。结果:1.造模后一周:在定位航行实验中,假手术组的大鼠从第一天开始到第四天找到逃逸平台的时间在不断减少。训练的第二天及第三天与假手术组相比,模型6周组及中药组找到平台的时间较长,差异有统计学意义(P<0.05),训练第四天有显著差异(P<0.01)。在空间搜索实验中,与假手术组大鼠相比,模型6周组及中药组在原平台处滞留时间、穿越次数及运动总距离,有效区域滞留时间及运动总距离均减少,且有明显差异(P<0.01)。而中药组与模型6周组的组间比较无统计学差异(P>0.05)。2.治疗6周后:在定位航行实验中,假手术组与中药组大鼠随着训练天数的增加,找到平台的时间不断地缩短。与假手术组相比,模型6周组从训练第2天到第4天的逃避潜伏期有显著差异(P<0.01);与模型6周组相比,经过中药6周治疗的大鼠逃避潜伏期明显缩短,有显著差异(P<0.01)。在空间搜索实验中,与假手术组大鼠相比,模型组在原平台处滞留时间、穿越次数及运动总距离,有效区域滞留时间及运动总距离均明显减少,且有统计学意义(P<0.05)。而与模型6周组相比,中药组的各项数据均得到不同程度的改善且有统计学意义(P<0.05)。结论:改良-两血管阻断法(2VO)永久性结扎模型能较好的模拟血管性认知障碍的发病机制,造模后的行为学改变也符合临床表现,是较为可靠的血管性认知障碍动物模型。中药益神方治疗血管性认知障碍模型大鼠后,明显改善其空间学习能力及空间记忆能力。实验二益神方对血管性痴呆大鼠海马神经元凋亡的保护作用目的:探讨血管性认知障碍对于海马神经元的损伤,益神方对于血管性认知障碍大鼠海马神经元的保护作用及相关机制。方法:TTC染色观察大鼠脑梗面积;HE染色法观察大鼠海马CA1及CA3区神经元形态;免疫组化法检测大鼠海马CA1、CA3区Neu N、m TOR阳性细胞百分比;Western Blot法检测大鼠海马组织Bax、Bcl-2、m TOR蛋白水平。结果:TTC染色结果显示:假手术组大鼠未见明显的梗死区域。2-VO模型6周组大鼠大脑存在明显缺血区,而经过益神方6周治疗后的大鼠脑内未见明显梗死灶。HE染色法显示:假手术组大鼠海马CA1及CA3区神经元结构完整,椎体细胞排列整齐密集,细胞核完整。模型2周组、模型4周组及模型6周组大鼠大脑海马区均可见椎体细胞层排列松散、有凋亡小体,核固缩、出现空泡。中药组显著改善神经元形态,核固缩现象明显减少,椎体细胞排列较模型组紧密完整,细胞形态正常。免疫组化结果显示:在大鼠海马CA1及CA3区,与假手术相比,各模型组的Neu N阳性染色细胞百分比显著减少(P<0.01),中药组的Neu N阳性染色细胞百分比与模型6周组相比明显增多(P<0.01)。在海马CA1区,与假手术相比,各模型组的m TOR阳性染色细胞百分比显著增高(P<0.01),且随时间而递增。与模型6周组相比,中药组的m TOR阳性染色细胞百分比降低,有显著差异(P<0.01)。模型2周组的m TOR阳性染色细胞百分比相较模型6周组降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。在海马CA3区,各模型组大鼠m TOR阳性染色细胞百分比显著增多,且有随天数增加而递增的趋势。与假手术相比,模型2周组m TOR阳性染色细胞百分比降低,差异有统计学意义(P<0.05),而模型4周及模型6周组显著降低(P<0.01)。中药组阳性染色细胞百分比明显减少,与模型6周组相比,有显著差异(P<0.01)。与模型6周组相比,模型后2周的m TOR阳性细胞百分比明显减少,有统计学差异(P<0.05)。Western Blot结果显示:与假手术组相比,模型2周组、模型4周组、模型6周组大鼠海马中的Bcl-2蛋白表达明显下调(P<0.01),随天数增加而下降,与模型6周组相比,模型2周组明显增高(P<0.01);在中药治疗6周后,Bcl-2蛋白表达明显有增高趋势,与模型6周组相比,中药组大鼠海马的Bcl-2蛋白表达增多,有显著差异(P<0.01)。与假手术组相比,各模型组大鼠海马中的的Bax蛋白表达明显增多(P<0.01),模型组随周数增加呈现增多趋势,与模型6周组相比,模型2周组有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);在中药治疗6周后,Bax蛋白表达明显有下降趋势,与模型6周组相比,中药组大鼠海马的Bax蛋白表达明显减少(P<0.01)。与假手术组相比,各模型组大鼠海马区的Bcl-2/Bax明显下降(P<0.01),模型组随天数增加而下降,但是组间比较无统计学意义(P>0.05);在中药治疗6周后,Bcl-2/Bax蛋白表达明显有增高趋势,与模型6周组相比,中药组大鼠海马Bcl-2/Bax明显增多(P<0.01)。在大鼠海马区,与假手术组相比,模型2周组、模型4周组及模型6周组的m TOR蛋白表达明显增加(P<0.01),随天数增加,大鼠海马区的m TOR表达呈现增多趋势,与模型6周组相比,模型2周组的表达有所降低,差异有统计学意义(P<0.05);经过益神方治疗6周后,中药组大鼠海马区的m TOR表达减少,与模型6周组相比有明显统计学差异(P<0.01)。结论:大脑缺血缺氧导致VCI模型大鼠神经元细胞的凋亡和缺失,诱发凋亡相关因子生成,同时与神经元的构成、凋亡、自噬密切相关的m TOR通路在海马CA1、CA3区过表达,导致学习记忆能力的下降。而益神方可抑制大鼠海马区神经元细胞的凋亡,其机制可能是通过对m TOR信号通路的调控,最终起到改善血管性认知障碍大鼠的学习记忆能力。