论文部分内容阅读
现代药物研究面临发展更安全、更有效的治疗药物的挑战。鉴定小分子药物靶标蛋白是药物研发的前提和关键步骤。一旦能够确定药物的靶标蛋白,就可以通过构效关系优化药物的结构,提高药效,并能够预测可能出现的副作用,降低新药开发的风险。尽管许多药物的治疗效果在临床实验前期和临床实验中已得到证实,但人们对大多数药物的确切作用机理和靶标仍知之甚少。这主要是因为小分子药物的靶标鉴定是一件令人生畏的工作。虽然目前已经发展了多种新的靶标鉴定方法,如化学蛋白组学、噬菌体展示、酵母三杂交等,但是这些技术依然需要亲和色谱对靶标蛋白的富集与纯化。而长期以来,有关亲和色谱的基质改进很少,一直使用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺颗粒。这一类的亲和分离材料在靶标蛋白分离纯化时步骡繁琐,耗时,效率较低。因此发展一种快速分离、高效的亲和基质就显得非常必要。
本论文的目的是设计和合成具有纳米尺寸的亲和选择性磁性纳米粒子用于细胞破碎液中小分子药物靶标蛋白的富集纯化,然后采用蛋白组学技术对分离纯化的蛋白进行鉴定。这一小分子药物靶标鉴定的策略具有简便、快速的特点,希望能够成为一种有效的靶标蛋白鉴定方法。
第一章对近年来用于靶标蛋白鉴定的新技术进行了评述,详细介绍了一些小分子药物靶标鉴定技术,同时还详细介绍了磁性纳米粒子合成、修饰及应用的最新进展。
第二章我们合成并功能化修饰了具有核壳结构的磁性纳米粒子,用于药物靶标的鉴定。首先,我们利用微乳液法制备分散性好、粒径均匀的硅胶包裹磁性纳米粒子以保护Fe3O4磁性纳米核,然后在硅胶表面聚合一层甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA),消除硅胶层对蛋白质的非特异性吸附,并引入活性官能团环氧基以便于进一步引入固定化小分子的连接臂。进一步在聚合物的表面进行化学处理引入亲水性连接臂使磁性纳米粒子的牛物兼容性更好。经过对小分子固载条件及蛋白富集过程中洗脱条件的优化,我们成功地利用这种亲和磁性纳米粒子从细胞破碎液中富集得到模型分子环孢素A和达沙替尼的靶标蛋白,并利用高分辨质谱鉴定可能的靶标蛋白。
第三章在上一章工作的基础上我们合成了一种聚苯乙烯作为外层壳的多层核-壳结构磁性纳米粒子,用于靶标蛋白的富集。乳液聚合的方式形成的苯乙烯外层壳层光滑、无孔的特点可以消除硅胶非特异性吸附。聚苯乙烯表面通过GMA的种子聚合引入丰富的活性官能团以引入连接臂和固载小分子。利用这种固载活性小分子的磁性纳米粒子我们成功地从细胞破碎液中富集得到环孢素A和达沙替尼的靶标蛋白。蛋白质的质谱分析结果显示,这种方法能显著提高基质的亲和富集效率。
第四章我们以聚苯乙烯包裹磁性纳米粒子为基质,富集细胞氧化损伤的标志物:4-羟基壬烯醛(4-HNE)修饰肽。首先我们制备了聚苯乙烯、硅胶双层包裹的核-壳结构磁性纳米粒子,并利用GMA对聚苯乙烯表面进行化学修饰以引入连接臂。我们利用化学方法在磁性纳米粒子表面引入肼基官能团,通过肼基与醛基的化学反应来富集4-HNE修饰肽。通过肼与醛反应的可逆性将磁性纳米粒子富集得到的4-HNE修饰肽从粒子上重新释放出来用于质谱分析定量。质谱结果显示这种方法可以高选择性、高效率地从复杂生物体系中富集得到4-HNE修饰肽,而且磁性纳米粒子可以重复使用。