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脑胶质瘤是位于大脑和脊髓胶质细胞发生癌变后所产生的原发性颅脑肿瘤,是神经外科常见恶性肿瘤。化学药物治疗是胶质瘤患者手术切除后的重要手段,但因其生长部位具有特殊性以及血脑屏障的作用而严重影响化疗效果,胶质瘤耐药性极强等,是胶质瘤化疗失败的主要原因。因此研究化疗药耐药相关作用机制,寻找耐药相关靶点对临床治疗有指导意义。HDAC1属于第一类组蛋白去乙酰化酶,与肿瘤发生发展密切相关。本实验拟建立HDAC1过表达和低表达细胞株,观察不同水平的HDAC1对胶质瘤细胞U87MG耐药程度的影响,并探讨其作用机制,进一步为提高胶质瘤化疗药敏感性奠定基础。目的:探讨组蛋白去乙酰化酶HDAC1过表达及低表达对胶质瘤化疗药耐药程度的影响及其作用机制。方法:第一部分:1.HDAC1稳定过表达细胞株U87MG-HDAC1的建立从胶质瘤U87MG细胞中提取总RNA,经过RT-PCR反应,TA克隆,酶切鉴定及基因序列分析鉴定,回收纯化HDAC1基因片段,将HDAC1片段与空载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro连接得连接产物pCDH-CMV-MCS-HDAC1-EF1-Puro,转化stbl3感受态细胞后提取质粒,细胞293T包装病毒,感染U87MG细胞,嘌呤霉素筛选,Western Blot免疫印迹法测定HDAC1表达量,建立HDAC1稳定过表达细胞株U87MG-HDAC1及其阴性对照U87MG-Control。2.HDAC1低表达细胞株U87MG-HDAC1-RNAi的建立针对HDAC1目的序列,按照shRNA要求合成oligo DNA,经退火反应形成双链,与GV-248载体进行连接,连接产物经转化和质粒提取,293T细胞包装病毒,感染胶质瘤U87MG细胞,嘌呤霉素筛选,Western Blot免疫印迹法测定HDAC1表达量,建立HDAC1稳定低表达细胞株U87MG-HDAC1-RNAi及其阴性对照U87MG-NC-RNAi。第二部分:HDAC1过表达和低表达对化疗药耐药程度的影响将实验对象分为hdac1过表达组(u87mg-hdac1&u87mg-control)和hdac1低表达组(u87mg-hdac1-rnai&u87mg-nc-rnai)。分别用vm-26和ddp两类药物处理两组细胞。vm-26药物作用终浓度分别为:0.1、0.5、2.5和12.5μg/ml;ddp药物作用终梯度浓度分别为:0.08、0.4、2和10μg/ml。药物vm-26或ddp作用细胞48h后,mtt法分别检测过表达组和下调组细胞存活率的改变;hoechst/pi双染法检两组凋亡形态学变化,westernblot检测两组细胞凋亡相关蛋白bax、caspase-3和bcl-2表达情况。结果:第一部分:1.正确扩增hdac1基因编码区并包装过表达慢病毒载体pcdh-cmv-mcs-hdac1-ef1-puro,建立hdac1稳定过表达细胞株,westernblot结果显示u87mg-hdac1组中hdac1蛋白的表达较u87mg-control组显著增加(1.148±0.024vs0.580±0.003,p<0.01)。2.正确设计合成hdac1shrna双链结构并包装低表达慢病毒载体gv248-hdac1-rnai,建立hdac1稳定低表达细胞株u87mg-hdac1-rnai,westernblot结果显示u87mg-hdac1-rnai组中hdac1蛋白的表达较u87mg-nc-rnai组显著下调(0.705±0.009vs0.352±0.006,p<0.01)。第二部分:hdac1的过表达和低表达对药物处理后耐药程度的影响mtt细胞活性实验结果显示,vm-26和ddp两种药物分别处理后,过表达组(u87mg-hdac1&u87mg-control)两细胞株存活率均呈浓度依懒性地降低;在相同的vm-26或ddp各个浓度,u87mg-hdac1存活率显著高于u87mg-control细胞株(p<0.05);vm-26作用下u87mg-hdac1的ic50值是u87mg-control的3.11倍,ddp作用下u87mg-hdac1的ic50值是u87mg-control的2.60倍。vm-26和ddp两药物分别处理后,低表达组(u87mg-hdac1-rnai&u87mg-nc-rnai)两株细胞存活率均随药物浓度增大而降低;在同一vm-26或ddp浓度下,u87mg-hdac1-rnai存活率明显低于u87mg-nc-rnai细胞株(p<0.05);vm-26作用下u87mg-hdac1-rnai的ic50值是u87mg-nc-rnai的0.49倍,ddp作用下u87mg-hdac1-rnai的ic50值是u87mg-nc-rnai的0.62倍。hoechst33258/pi双染法观察,vm-26和ddp两种药物处理后,过表达组(U87MG-HDAC1&U87MG-Control)两细胞株均随浓度增大,凋亡细胞比例增大;在相同的VM-26或DDP各个浓度下,U87MG-HDAC1细胞株凋亡细胞比例显著低于U87MG-Control。VM-26和DDP两种药物处理后,低表达组(U87MG-HDAC1-RNAi&U87MG-NC-RNAi)两细胞株均随浓度增大,凋亡细胞比例增大;在相同的VM-26或DDP各个浓度下,U87MG-HDAC1-RNAi细胞株凋亡细胞比例显著高于U87MG-Control-RNAi。Western blot免疫印迹结果显示,VM-26和DDP两种药物处理后,过表达组(U87MG-HDAC1&U87MG-Control)两细胞株,随药物浓度增大,Bax、Caspase-3随之增大,Bcl-2表达则降低;在相同的VM-26或DDP各个浓度下,U87MG-HDAC1的Bcl-2/Bax值显著高于U87MG-Control(P<0.05),而Caspase3表达量显著低于U87MG-Control(P<0.05)。VM-26和DDP两种药物处理后,低表达组(U87MG-HDAC1-RNAi&U87MG-NC-RNAi)两细胞株,随药物浓度增大,Bax、Caspase-3表达均增强,Bcl-2则降低;在相同的VM-26或DDP各个浓度下,U87MG-HDAC1-RNAi的Bcl-2/Bax值显著低于U87MG-NC-RNAi(P<0.05),而Caspas-3表达量显著高于U87MG-NC-RNAi(P<0.05)。结论:1.成功构建HDAC1稳定细胞株U87MG-HDAC1及其阴性对照U87MG-Control。2.成功构建HDAC1稳定低表达细胞株U87MG-HDAC1-RNAi及其阴性对照U87MG-NC-RNAi。3.HDAC1过表达与低表达,导致化疗药物处理后细胞耐药性的增强或减弱,与Bax/Bcl-2的比值及Caspase-3的表达量密切相关。