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研究背景蟾皮为蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufogargarizans Cantor或黑框蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的干燥皮,是中国的传统中药。具有清热解毒,利水消胀的功效。主要用于治疗痈疽,肿毒,瘰疬,肿瘤,疳积腹胀,慢性气管炎。蟾皮中的主要成分包括亲水性的核苷,氨基酸和吲哚烷胺类生物碱(IAAs)及亲脂性的蟾毒配基类。其中,蟾毒配基类化合物是发挥抗肿瘤作用的主要物质基础。然而,蟾皮无论在传统应用还是临床制剂的制备,如华蟾素注射液,华蟾素口服液,华蟾素片等,均是以水提取为主要工艺,因此含大量的亲水性成分,其中,IAAs是重要的亲水性活性成分之一,但其药理活性未见报道。大量研究表明含吲哚环的生物碱具有很好的抗炎活性,推测蟾皮中的IAAs可能具有抗炎活性。鉴于蟾皮中药制剂含大量IAAs等亲水性成分,因此,对该类成分进行系统的研究分析,可为指导蟾皮的临床用药提供科学依据。目的本研究对蟾皮中亲水性化学成分进行定性定量分析,阐明其亲水性物质基础,并利用LPS刺激的中性粒荧光斑马鱼和小鼠原代中性粒细胞为炎症模型,从体内和体外两个层面对重要亲水性成分IAAs进行抗炎活性评价,为指导蟾皮的临床应用提供理论依据。方法1.本研究从中药化学的角度出发,利用现代经典植物化学分离技术,定向分离蟾皮中的IAAs成分。再进一步采用核磁(1H-NMR,13C-NMR),高分辨质谱(UHPLC-HR-MS)等技术对单体化合物进行结构鉴定。2.本研究采用UHPLC-Orbitrap-MS技术对3类不同结构的IAAs进行质谱裂解规律的分析和总结,用于推导未知生物碱类成分,同时根据对照品和文献报道对其他亲水性成分进行指认。另一方面,利用UPLC-QqQ-MS/MS技术,对蟾皮和蟾酥中亲水性部位的主要色谱峰进行系统的方法学考察和含量测定。3.利用LPS刺激的中性粒荧光斑马鱼炎症模型来评价IAAs的抗炎活性;其次,结合实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)对样本的炎症因子及相关炎症通路上关键蛋白的基因表达量进行检测。4.利用靶向及非靶向脂质组学技术对样本进行轮廓分析,筛选出与炎症相关的潜在脂质标志物。5.利用网络药理学技术筛选与差异代谢脂质关系密切的酶,从而推测IAAs发挥抗炎活性可能的作用靶点。6.利用酶联免疫吸附法(ELISA)检测IAAs干预后,LPS介导的小鼠中性粒细胞促炎因子(IL-6,TNF-α,IL-1β)变化;利用Annexin V/PI双染检测细胞调亡。同时用Western blot对凋亡相关蛋白(Bcl-2,Bax,Cleaved caspase-3)及自噬相关蛋白(Beclin 1,LC-3-I,LC-3-Ⅱ)进行检测。结果1.蟾皮中亲水性成分的提取分离:共从蟾皮中定向分离出6个IAAs,经核磁和高分辨质谱鉴定,分别为5-羟色胺,N-甲基-5-羟色胺,蟾蜍色胺,蟾蜍特尼定,脱氢蟾蜍色胺和蟾蜍噻咛。2.蟾皮和蟾酥亲水性成分的定性定量分析:从蟾皮和蟾酥中共指认出38个亲水性成分,包括氨基酸,核苷,多肽及IAAs等多种化学成分。其中蟾皮中指认出36个成分(包含17个IAAs,其中推导出3个新的IAAs),蟾酥中指认出22个成分(包含10个IAAs)。根据质谱指认结果,对11批蟾皮和4批蟾酥样品中11个含量较高的亲水性成分进行了定量分析,其中包括6个IAAs。结果表明,IAAs在二者中的含量均比核苷及氨基酸类成分要高;定量结果经多元统计分析处理,筛出5个差异较大的化合物,其中包括4个IAAs,可作为蟾皮和蟾酥亲水性成分中一类差异化合物。3.IAAs对LPS刺激的中性粒荧光斑马鱼炎症模型的抗炎活性评价:5个IAAs对中性粒荧光炎症模型均有一定的抗炎活性,可降低LPS引起的卵黄囊中性粒细胞个数的增多;RT-PCR结果显示,5个IAAs均可回调LPS引起的炎症因子(IL-6,TNF-α,IL-1β,IFN-γ 和 IL-10)及 MyD88-NF-κB 和 MyD88-MAPK炎症信号通路相关蛋白(IκB-α,p65,ERK1,JNK1和P38a)的基因表达水平。4.靶向脂质组学最终筛出33个潜在的病理脂质Marker,包括14个SM,6个Cer,2个GlcCer,11个PC,这些脂质标志物主要涉及的代谢通路为鞘脂类代谢和甘油磷脂类代谢。非靶向脂质组学筛出18个潜在脂质标志物,包括15个三酰甘油(TG),2个鞘磷脂(SM)和1个神经酰胺(Cer)。5.利用网络药理学技术,基于拓扑特征(在网络中发挥关键作用),共筛出26个预测酶参与差异脂质的调节。在这些酶中,磷脂酶A2(PLA2)和溶血磷脂酰胆碱酰基转移酶(LPCAT)与PC的代谢有关。LPS结合蛋白(LBP)和鞘磷脂磷酸二酯酶(SMPD)是显示与SM和Cer的代谢有关。鞘脂合成酶(SGMS)与PC,SM和.Cer的代谢相关。6.IAAs对小鼠原代中性粒细胞功能的影响:6个IAAs处理2h后,对LPS引起的小鼠原代中性粒细胞中炎症因子(IL-6,TNF-α)的升高有显著性回调作用。其中,蟾蜍色胺处理16h后,与模型组相比,可明显提高凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达量,而自噬相关蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ/LC3-I的表达无显著性变化。结论1.IAAs为蟾皮和蟾酥主要的亲水性成分之一,且以游离型生物碱为主;蟾酥中IAAs含量远远高于蟾皮。2.IAAs对LPS刺激的中性粒荧光炎症模型有明显的抗炎作用,可通过抑制TLR4-MyD88-NF-κB和TLR4-MyD88-MAPK炎症通路相关蛋白基因的表达,从而降低体内促炎因子IL-6,TNF-α和IL-1β的分泌,从而调节炎症;脂质稳态调节,如对SM,Cer,PC的代谢调节可能是IAAs发挥抗炎作用的另一机制,其中与差异脂质代谢相关的酶LBP,PLA2,CERK,SMPD和SGMS可能是IAAs发挥抗炎活性作用的相关靶点。3.IAAs在体外可下调由LPS引起的中性粒细胞炎症因子分泌增多,其机制可能与促进线粒体介导的内源性凋亡途径有关。