牡丹皮是毛茛科芍药属植物牡丹(Paeonia suffruticosa)的干燥根皮,具有清热凉血,活血化瘀之功效。在中医中应用已达几千年之久,是大宗常用中药之一。牡丹皮始载于《神农本草经》,列为中品;含有牡丹皮的处方首次出现在《金匮要略》。《本草纲目》论述:牡丹皮,治手足少阴、厥阴四经、血分伏火。另外,牡丹皮在《本草经疏》、《得配本草》、《本草汇言》等各家著书中均有记载和论述。近代药理学研究表明牡丹皮具有抗炎、抗菌,调节心血管系统,中枢抑制,调节免疫功能,保肝等作用。但是,关于牡丹皮的研究仍然存在一些不足,如质量评价方法过于依赖一两个指标含量,其发挥疗效的药理学分子作用机制不清楚等。目的:对牡丹皮质量进行系统评价,探索建立以形态、显微、多成分含量及指纹图谱结合的牡丹皮质量评价体系。结合新提出的“质量标志物”的概念,选取具有可追溯性和可传递性的牡丹皮有效成分,建立快速可靠的UHPLC多成分定量方法。研究芍药属牡丹组不同种植物的根皮代谢组轮廓,从化合物水平对牡丹组植物分类提供新视角和依据。对牡丹皮主要成分及其提取物在Hep G2细胞模型上进行二代高通量测序研究,为牡丹皮传统疗效的药理学机制的揭示和潜在药理学功能的探索进行基因和转录组水平的初步研究。方法:本研究采用高效液相色谱法对牡丹皮多成分含量进行定量;HPLC-MS/MS方法对丹皮提取物进行总离子流的扫描和6个主要成分的定量;HPLC-Qtof-MS对芍药属牡丹组和牡丹植株不同部位进行代谢组学全轮廓分析;另外使用显微切片观察的方法对丹皮显微特征进行描述;采用虚拟筛选和高通量测序的方法对丹皮有效成分及其提取物进行药理活性的筛选;本研究还采用了多种数据可视化和数据分析的软件,如SIMCA-P,ChemPattern,Graphpad prism 5,Metaboanalyst 3.0,Cytoscape,R语言包GO plot等等。结果:1.本实验建立了基于形态、显微、多成分含量测定以及指纹图谱的牡丹皮质量评价体系。采集了全国主要产区和药材市场上的牡丹皮药材与饮片,从形态上比较了丹皮主要产区安徽亳州和道地产区安徽铜陵的牡丹皮的差异。牡丹皮粉末和牡丹根部木芯粉末的主要显微特征有显著差别,丹皮粉末中含有大量的淀粉粒和草酸钙簇晶,而木芯粉末中含有大量的导管。对牡丹根部横切面显微特征进行了描述,并首次报道了牡丹根部木芯具有“植物年轮”,对植物年限的判断有指导意义。通过17个成分含量测定比较了主产区安徽亳州和道地产区安徽铜陵产牡丹皮药材的差别,发现亳州牡丹皮PGG含量显著高于铜陵牡丹皮(P<0.01)。并联合多成分含量测定和指纹图谱结果比较了不同年限、丹皮和木芯以及丹皮药材和饮片的主要成分含量的差别。2.完成了对芍药属牡丹组植物和牡丹植株不同部位的代谢组学全轮廓分析,并且建立了芍药属化合物库。这为牡丹组不同种间的分类关系提供了代谢组学的依据。3.基于“质量标志物”的概念,通过对牡丹皮化学物质组辨识明确化学物质基础,并通过牡丹皮主要成分的生源途径及成分特异性分析明确其化学成分的来源及特异性。整理牡丹皮药理活性的报道并进行主要化学成分的虚拟筛选,并结合已报道的牡丹皮尿液血清药代动力学结果分析,明确牡丹皮的主要药效物质基础;分析确定氧化芍药苷,丹皮酚新苷,芍药内酯苷,丹皮酚原苷,芍药苷,PGG,牡丹皮苷C,丹皮酚,8个成分为牡丹皮质量标志物。建立了牡丹皮多指标成分定量测定及指纹图谱控制方法。4.利用牡丹皮中的代表性的活性成分丹皮酚、芍药苷、PGG、丹皮酚新苷、没食子酰芍药苷以及牡丹皮提取物,作用于Hep G2细胞后进行HTS~2分析,在转录水平找到各个化合物及丹皮提取物作用后Hep G2细胞发生变化的基因,并且通过GO和KEGG富集,找到相关的通路和差异表达基因。联系已有文献报道的活性和机制研究的结果,为牡丹皮的传统中医药理论和未来药理学的研究贡献了新的思路。另外,药理实验也发现了丹皮酚能显著降低酸化诱导刺激的关节软骨细胞中程序性坏死相关蛋白的表达。结论:综上,本研究采用多种方法联合使用的方式可以更系统全面的评价牡丹皮的整体质量差异。建议在丹皮质量评价标准中增加芍药苷一项,并推荐了含量的最低限量。另外,我们也推荐了牡丹皮的8个质量标志物,系统总结了8个质量标志物的生物合成途径、药理学活性、以及其体内代谢产物等。最后,对牡丹皮有效成分进行高通量测序研究,并进行GO分析,阐述了其可能的药理学作用和潜在的治疗多种疾病的机制。