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宿主限制因子是由宿主细胞产生,通过影响病毒复制周期的不同环节,从而抑制病毒复制与传播的一类细胞蛋白,是宿主防御病毒侵袭的一道屏障。而病毒在进化过程中也产生相应的策略来克服这些屏障。因此宿主与病毒之间的相互作用近年来成为病毒学领域的研究热点。BST-2(又称HM1.24, tetherin或CD317)是宿主体内抑制囊膜病毒释放的限制因子,它的抗病毒作用可被HIV-1的辅助蛋白Vpu所拮抗,这种拮抗作用由二者跨膜区的相互作用介导,但BST-2和Vpu跨膜区相互作用的具体分子机制还仍在继续探索中,为此,我们应用生物发光共振能量转移(BRET)方法,在活细胞内重现BST-2和Vpu之间的相互作用,同时将两种蛋白质的整个跨膜区分别进行联合及单点突变,通过BRET信号的变化鉴定出它们相互作用的关键氨基酸位点,并验证这些影响相互作用的关键位点也影响了Vpu对BST-2的拮抗作用。同时,我们基于BRET方法建立了BST-2和Vpu在细胞内稳定共表达的细胞系,并将其作为一种高通量筛选工具,针对两种蛋白质跨膜区相互作用这样一个潜在的药物靶标,筛选出了小分子化合物抑制剂PR,并对其进行了初步的功能验证。具体研究结果如下：一.BST-2和Vpu跨膜区相互作用关键氨基酸位点的鉴定我们首先将BST-2和Vm (Vpu S52,56A)的N端或C端与生物发光共振能量转移的供体蛋白Renilla luciferase (Rluc)或受体蛋白EYFP融合构建,按不同组合(包含供体蛋白和受体蛋白)在293T细胞内共表达后,检测BRET信号,发现N端融合Rluc的BST2(Rluc-BST2)和C端融合EYFP的Vm (Vm-EYFP)共表达后产生与阳性对照相当的BRET信号,从而确定应用于此研究的最佳组合为Rluc-BST2和Vm-EYFP,并通过饱和实验和竞争实验验证BRET方法在研究BST-2和Vpu相互作用中的特异性。而后将两种蛋白质跨膜区分别进行突变,转染293T细胞后,检测BRET信号的变化。我们发现,BST-2的I34、L37、P40和L41,以及Vpu的L11、A18和W22位点突变后,BRET比值明显降低,说明这些位点为BST-2和Vpu相互作用的关键位点。其中,BST-2的P40位点以及Vpu的L11位点为我们首次发现。另外,我们还发现Vpu跨膜区三位氨基酸联合突变体14-16(AII-VAA)和26-28(IIE-AAA)能明显降低BRET信号,但将该范围内的氨基酸进行单点突变后却并未发现上述现象。我们将首次鉴别出的这些氨基酸突变体进行了分子动力学模拟分析,发现这些突变体明显改变了BST-2和Vpu跨膜区复合物的构象,从而影响了两种蛋白质的相互作用。功能实验证实了这些关键氨基酸位点的突变影响了Vpu拮抗BST-2抗病毒作用的能力。二.小分子化合物抑制剂的筛选和初步功能验证将质粒Rluc-BST2和Vpu-EYFP构建到一种双表达载体中,并利用构建的双表达质粒,建立了Rluc-BST2和Vpu-EYFP稳定双表达的293细胞系,将此细胞系作为筛选模型,以BST-2和Vpu之间的相互作用为靶点,对小分子化合物进行了筛选。以BRET信号降低作为筛选阳性指标。经过对12000种小分子化合物的筛选,初步筛选出了27种阳性化合物。经过后期的功能验证排除了大部分化合物,最终确定了一种化合物PR作为最终的筛选阳性结果。初步功能验证发现该种化合物能特异性恢复细胞内BST-2的表达水平,进而抑制病毒的释放。即化合物PR能通过干扰BST-2和Vpu之间的相互作用,从而影响Vpu对BST-2抗病毒功能的拮抗,恢复BST-2固有的限制因子活性。综上所述,本研究首次应用BRET技术在活细胞内对BST-2和Vpu之间的相互作用进行了研究,鉴定出了BST-2和Vpu跨膜区相互作用的关键氨基酸位点。并以此技术为基础首次创立了以BST-2和Vpu之间的相互作用为明确靶点的小分子化合物抑制剂筛选模型,并对筛选出的阳性化合物进行了初步功能验证。本研究结果对进一步阐明BST-2和Vpu之间的相互作用机制提供了可靠的研究数据,为抗HIV-1药物的筛选提供了新途径,以及对将来抗HIV-1药物的研发提供了新的候选。