癫痫(Epilepsy)是世界上最古老的疾病之一,希腊名医希波克拉底早在公元前5世纪就首次记录过癫痫的发作。它是一种由于大脑神经元突发性、反复性、发作性异常放电,导致短暂的大脑神经系统功能障碍的慢性疾病。癫痫现已成为仅次于脑卒中的第二大神经系统疾患。临床常表现为神经元反复放电而引起反复的惊厥发作,且具有不可预见性。目前全球约5000万癫痫病人,然而手术风险高且难以根治,药物治疗中将近30%的癫痫患者因抗癫痫药物无法控制其发作而发展为顽固性难治性癫痫,难治性癫痫中有70%为颞叶癫痫。癫痫不仅明显降低了患者的生活质量,同时给家庭和社会增加了严重的心理和经济负担。因而寻求积极有效的治疗手段是癫痫研究领域的热点问题。双孔钾离子通道(Two-pore-domain potassium channels,K2P)是最新发现的一类钾离子通道亚型,哺乳动物的K2P可分为六类,共包括16个亚型,其中包括TWIK(弱内向整流型双孔钾通道)、TASK(酸敏感TWIK相关双孔钾通道)、TREK(TWIK相关双孔钾通道)等亚家族。TREK-2是K2P中最重要的一员,也是K2P中分布最广表达最多的亚类,它与TREK-1和TRAAK由于序列结构和调控机制的相似同属TREK一类。TREK-2具有重要的生理和神经保护作用,已经有研究证实TREK-2广泛表达于神经元并在调控神经元兴奋性方面具有重要功能。而癫痫发病的电生理本质就是多种机制导致的神经系统兴奋与抑制平衡失调,产生神经元过度同步化放电。但是关于TREK-2在癫痫发生过程中的时空表达变化在国内外尚未见文献报道。本课题运用锂盐-匹罗卡品建立癫痫模型,以TREK-2双孔钾通道为研究中心,采用Western-blot、免疫荧光技术观察在匹罗卡品癫痫模型中不同时期TREK-2于癫痫主要好发部位的表达特点,并且通过si RNA干扰技术下调TREK-2的表达,进一步观察其对癫痫发作的影响。通过证实TREK-2双孔钾通道参与了癫痫的发生、发展,力图为抗癫痫药物的研制提供新的靶点并为癫痫治疗提供新的指导策略。实验一:匹罗卡品诱导实验性颞叶癫痫大鼠模型的建立目的:观察匹罗卡品癫痫模型中大鼠的行为学特点、脑电图变化和组织形态学变化。方法:(1)选用SPF级雄性SD大鼠,体重150g~200g。适应环境1周后,大鼠在清醒状态下,腹腔注射氯化锂180mg/kg,18~20h后腹腔注射东莨菪碱1mg/kg,30min后腹腔注射匹罗卡品30mg/kg,给药后根据Racine分级观察大鼠行为学改变。持续痫性发作(Racine 4级以上)为成功模型,1h后,给予地西泮10mg/kg腹腔注射以终止癫痫发作,降低死亡率。对照的正常组大鼠于相同时间给予同样剂量的生理盐水。(2)在大鼠皮层区埋藏电极,全程了解癫痫发作前后的EEG动态变化。(3)HE染色观察模型组大鼠癫痫后不同时期海马组织形态学变化。结果:(1)模型组在注射匹罗卡品后动物立即有不同程度的胆碱能反应,如唾液分泌增多、流泪、腹泻,15~20min左右,癫痫发作,表现为胡须抖动,点头,面部抽搐,前肢和/或尾伸直、僵硬姿势,全身性阵挛抽搐,随后表现为全身性强直阵挛抽搐或伴站立和跌倒。模型组大鼠中89.8%有明显的癫痫样发作,存活率达75%。正常组大鼠未见癫痫样发作。(2)模型组大鼠给予匹罗卡品后EEG均观察到阵发性痫性放电,多见高电位的丛集性棘波、尖波、棘尖波。正常组大鼠EEG均表现为基础波,未观察到棘波、尖波等痫性波;(3)与正常组相比,模型组大鼠癫痫后不同时期HE染色发现海马各区有不同程度的神经元缺失,CA1和CA3较CA2和DG区缺失更为明显。结论:成功建立癫痫模型,且存活率高,便于之后实验的进展。实验二:TREK-2在癫痫模型中不同时期海马区与EC区的表达变化及其与癫痫发病的关系目的:观察匹罗卡品癫痫模型中不同时期海马区和EC区TREK-2蛋白的表达变化,初步探讨TREK-2在癫痫发病过程中的作用。方法:随机数字表将56只成功癫痫模型大鼠于发作后6h、1d、3d、1w、2w、4w、8w分别迅速断头处死后剥离右侧海马组织和EC区组织,各时间点8只,标记后置于-80℃冰箱中备Western-blot检测TREK-2的表达,正常组8只采取同样处理。另外各时间点另取3只灌注后行免疫荧光染色检测,正常组3只采取同样处理。结果:(1)在海马区,Western-blot统计结果显示,与正常组相比,TREK-2在诱导痫性持续发作后的3d开始降低(P<0.05),1w,2w,4w明显降低(P<0.01),8w时仍维持在很低水平(P<0.001),免疫荧光结果显示了同样趋势。(2)在EC区,Western-blot统计结果显示,与正常组相比,TREK-2在诱导痫性持续发作后的1d明显降低(P<0.001),到2w时基本恢复到正常水平(P>0.05),之后继续降低,8w时降到最低(P<0.001)。免疫荧光结果显示了同样趋势。结论:在癫痫模型中不同时期,海马区与EC区TREK-2的表达都不同程度的降低,证实TREK-2参与了癫痫的发生发展过程。实验三:下调海马区和EC区TREK-2对匹罗卡品癫痫模型发作的影响目的:利用TREK-2 si RNA下调海马区和EC区TREK-2表达,进一步观察对大鼠癫痫状态的影响。方法:(1)SPF级雄性SD大鼠在麻醉下(10%水合氯醛0.3ml/100g腹腔注射)固定于脑立体定位仪上,按照Paxinos定位海马位置,然后按坐标进针。注射位置要在相应部位埋套管针灌注后切取脑片确定。实验共需SD大鼠18只,随机分为正常对照组(sham),溶剂组(no si RNA),乱序RNA组(scr RNA),TREK-2 si RNA-A组(5n M),TREK-2 si RNA-B组(5n M),TREK-2 si RNA-B组(10n M),每组3只。以速度0.5μl/min,剂量2μl进行海马区微量注射。Sham组只打开皮肤钻孔但不注射任何药品。注射72h后取材,应用Western-blot检测相应海马组织中TREK-2的表达变化。(si RNA A序列:5’-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3’,si RNA B序列:5’-TAG GAG GGC GGA AAT ACC AAA-3’)(2)选取最佳干扰效能的TREK-2 si RNA B序列进行后续实验,将SD大鼠分为癫痫组和干扰癫痫组,采用上述同样方法进行海马区定位注射2μl的溶剂和si RNA B,72h后建立癫痫模型,并对其行为学进行观察。其中癫痫1d组5只和干扰组癫痫后1d存活的5只进行海马区Western-blot取材。EC区的实验过程同海马区。结果:(1)通过Western-blot对TREK-2 si RNA的干扰效能检测,结果显示正常对照组、溶剂组、scr RNA组之间无统计学差异,对TREK-2蛋白表达几乎没有影响。与scr RNA组相比,si RNA A可以下调TREK-2蛋白表达将近30%(P<0.05),si RNA B可以下调TREK-2蛋白表达将近50%以上(P<0.001),且不同浓度(si RNA B 5 n M vs si RNA B 10 n M)间无明显差异。因而选择si RNA B序列作为之后的干扰序列,浓度选用5n M。(2)si RNA干扰TREK-2蛋白表达后,建立癫痫模型,进行行为学观察发现,与癫痫组相比,干扰组癫痫发作程度明显增加。与癫痫1d组相比,干扰癫痫1d组TREK-2表达明显降低(P<0.01),与si RNA干扰组相比,干扰癫痫1d组TREK-2表达也明显降低(P<0.01)。结论:利用TREK-2 si RNA进一步证实TREK-2参与了癫痫的发生发展过程,降低海马区和EC区TREK-2的表达加重了癫痫发生。