背景来自太阳的紫外线辐射按其波长可分为315-400nm的紫外线A (ultraviolet A, UVA)、280～315nm的紫外线B (UVB)和100-280nm的紫外线C (UVC).太阳辐射通过地球大气层时,其中所有的UVC和90%以上的UVB能被臭氧和水汽等吸收,UVA则较少受影响。因此到达地面的紫外线主要是UVA和少量UVB。现阶段,随工业发展地球臭氧层空洞面积的不断增加,导致大气对太阳辐射特别是UVB的吸收减少,使地球上的人类受到的UVB辐射增加。人类皮肤覆盖于机体的表面,是抵抗外界刺激的第一道防线,照射到皮肤的紫外线95%左右被角质细胞所吸收。过量的UVB照射可引起皮肤出现红斑、炎症、老化甚至皮肤癌。以往研究表明,UVB可以通过以下主要四种途径破坏细胞,影响细胞正常功能和生存状况,导致细胞坏死或凋亡：1直接损伤细胞DNA：2激活神经鞘磷脂酶,使之降解神经鞘磷脂,增加“第二信使”神经酞胺及其衍生物水平；3活化CD95等细胞膜表面死亡受体；4经细胞膜和线粒体膜作用产生脂质过氧化产物和自由基。无论是通过哪一种途径,就纯粹的分子之间的相互作用而言,紫外线作用于细胞是通过紫外光子和细胞的分子成分之间发生了能量转移,能量转移的结果根据相互作用的能量高低分为两种：高于“电离能”时,直接破坏介质的原子和分子；低于“电离能”时则在使介质电子发生跃迁的同时被介质吸收。紫外线对机体皮肤细胞的光生物学作用主要是皮肤细胞发色基团对紫外光谱能量的选择吸收后,引起细胞内分子的激发,被激发的分子经过光辐射、内转换、碰撞等非辐射衰变方式、化学反应方式、能量传递方式等将能量转换回到基态。三种不同波长的紫外线其能量差异较大,损伤DNA的方式以及结果也有较大区别：UVB和UVC波长范围正好是在DNA的吸收峰附近,DNA就能够直接吸收其能量,形成环丁烷嘧啶二聚体、嘧啶酮光产物、嘧啶的单加和物和非二聚碱基损伤、嘌呤光产物等形式的损伤；UVA不能被DNA直接吸收,而是通过细胞中的光增敏剂将能量传递给DNA引起损伤,损伤的类型有碱基损伤、DNA链交联、DNA链断裂等。拉曼光谱(Ramanspectra)是一种散射光谱：当单色的入射光投射到物质中产生散射时,其中有一部分散射光与入射光频率不同,称为拉曼光谱。这一现象于1928年由印度物理学家拉曼首先发现。拉曼光谱技术应用于DNA大分子构象研究始于20世纪70年代初期,根据拉曼谱线(峰)的特征和位置(拉曼频移)来确定其所属的DNA功能基团或某一个分子键,以及判断哪些DNA功能基团和化学键发生改变而引起物质结构和功能上的损伤。本研究采用UVA和UVB照射HaCaT细胞后,提取细胞DNA进行拉曼光谱分析,根据拉曼光谱相应特征谱线的位置和强度变化情况研究UVA和UVB对HaCaT细胞DNA的损伤形式,进一步分析损伤过程中通过哪一具体的分子结构进行能量交换和作用。白藜芦醇是从百合科菝葜属植物菝葜的干燥根茎中提取出来的一种天然的二苯乙烯类化合物,可以降低丙二醛(MDA)的生成量,增加超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)及过氧化氢酶(CAT)的活性,清除自由基。白藜芦醇本身也对紫外线有较好的吸收作用,且含有的多酚结构能与DNA通过静电吸引和氢键作用。本试验通过拉曼光谱技术分析白藜芦醇在UVB致HaCaT细胞DNA损伤过程中,对DNA二级结构的保护作用。细胞自噬是广泛存在于真核细胞内的溶酶体依赖的降解途径,细胞内损伤的细胞器和蛋白质等可通过自噬作用被降解,降解产生的氨基酸、脂肪酸等产物再重新利用。生长因子缺乏、大量氧自由基、DNA损伤等皆可诱导自噬。根据细胞内的物质运送到溶酶体的途径,分为三种自噬途径：1巨自噬,自噬最主要的形式,细胞质中产生双层膜结构形成自噬小体,随后结合溶酶体形成自噬性囊泡,通过这一途径降解自噬内容物主要有线粒体、内质网以及核糖体等；2微自噬,溶酶体膜直接内陷包裹周围的待降解物质,然后在水解酶的作用下进行降解；3分子伴侣介导自噬,与巨自噬、微自噬的最大区别是没有膜性结构形成,而是细胞质内具有特殊基序的蛋白被分子伴侣识别后,与溶酶体膜上的特殊受体--溶酶体相关膜蛋白结合后进入溶酶体被降解。自噬是细胞对于环境变化的有效、快速反应,当细胞营养缺失时,细胞立即启动自噬以维持胞质中氨基酸池的平衡,可通过合成新的蛋白质、能量生成和促进糖异生来避免细胞“饿死”。小鼠胚胎成纤维细胞在饥饿诱导下,三十分钟后既可以检测出自噬特异性蛋白LC3-II的改变,而其他细胞的自噬水平的变化从开始到结束经历的时间各有不同,半衰期从8分钟到几小时。为研究HaCaT细胞受刺激后的自噬变化规律,本实验选用人永生化上皮细胞(HaCaT)作为研究对象,以波长为305nm的UVB作为刺激,观察照射后5h内的自噬变化。目的1、研究UVA和UVB对HaCaT细胞DNA二级结构的损伤情况。2、研究白藜芦醇在UVB致HaCaT细胞DNA损伤过程中对DNA二级结构的保护作用。3、研究UVB辐射对HaCaT细胞自噬影响的剂量反应关系和时间效应关系。方法1、细胞培养HaCaT细胞接种于60mm×15mm培养皿中,培养皿含体积分数为10%的小牛血清(Fetal bovine serum, FBS),单位为1×105U/L青霉素、质量浓度为100mg/L链霉素的DMEM高糖培养基,于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中常规贴壁培养。2、紫外辐射上海顾村光电仪器厂生产,并经上海市计量局检测,其发射的紫外线波峰为305nm。培养皿中细胞长至80%-90%融合时弃培养基,用1mlPBS漂洗2遍后加入1.8mlPBS覆盖细胞,放在距光源垂直距离为40Cmm位置进行照射。3、白藜芦醇预处理HaCaT细胞于UVB照射前加入白藜芦醇(使用终浓度0.1μpmol/ml)培养6小时,弃去含有白藜芦醇的培养基,1mlPBS漂洗2遍后照射方法同前。4、细胞全基因组DNA提取82.6mJ/cm2UVA和29.7mJ/cm2UVB照射细胞后继续培养至照射后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0和5.0h时间点收获HaCaT细胞,按照QIAamp DNA Mini Kit操作说明书步骤,分别对各组收获的HaCaT细胞进行全基因组DNA提取。5、激光共焦拉曼光谱测量采用激光共焦拉曼光谱倒置显微镜系统检测各组HaCaT细胞全基因组DNA的拉曼光谱：测量前采用标准硅片对激光共焦拉曼光谱倒置显微镜系统的波数轴和激光功率进行校准,以确保每次测量时照射到样品处的激光功率相同。实验时使用20倍物镜,光栅采用6001ines/mm,共焦孔径为500μm,采集的频率范围为600-2000cm-1,光谱分辨率为lcm-1,样品扫描曝光积分时间为30s,重复10次。6、吖啶橙(Acridine orange, AO)染色不同剂量UVB照射HaCaT细胞后,分别在照后1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h收集细胞进行染色,具体方法是：弃去培养皿中培养基,用1mlPBS清洗2次,再加入3m1浓度为5μg/ml的AO染液,置于C02培养箱中继续培养15min, PBS清洗3次后。荧光倒置显微镜下观察染色。7、Western blot检测细胞蛋白不同剂量的UVB照射HaCaT细胞后,分别在照后0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0h收集细胞,具体方法是：弃去培养皿中培养基,用上海博彩生物工程公司的试剂盒提取细胞总蛋白并定量后进行SDS-PAGE电泳,转膜、5%脱脂奶粉进行封闭,然后室温下一抗孵育2h、TBST漂洗3次,室温二抗孵育2h、TBST漂洗3次后化学发光反应,最后进行显影、定影。8、统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验符合正态分布或近似正态分布,以x±s描述,多组均数比较采用单因素方差分析；多重比较,方差齐时采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett-T3法,检验水准a=0.05。结果1、经UVA和UVB照射后DNA拉曼光谱的主要谱线轮廓未发生明显变化；三组细胞鸟嘌呤氢键、磷酸基静电斥力、腺嘌呤碱基分子内能和腺嘌呤碱基堆积力特征谱线强度变化差异有统计学意义(P<0.05)；多重比较结果中,仅UVA组与对照组鸟嘌呤氢键特征谱线强度变化差异不明显(P>0.05),其余各组各指标两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)；各组与照后时间呈现交互效应(P<0.05)。2、经UVB和UVB+白藜芦醇照射后DNA拉曼光谱的主要谱线轮廓未发生明显变化；三组鸟嘌呤氢键、磷酸基静电斥力、腺嘌呤碱基分子内能和腺嘌呤碱基堆积力特征谱线强度变化差异有统计学意义(P<0.05)；多重比较结果中,三组细胞鸟嘌呤氢键特征频率两两相比差异均有统计学差异(P<0.01),三组细胞磷酸基静电斥力特征频率两两相比仅UVB组和对照组差异具有统计学意义(P<0.05),三组细胞腺嘌呤碱基分子内能特征频率两两相比仅UVB组和UVB+白藜芦醇差异无统计学意义(P<0.05),三组细胞腺腺嘌呤碱基堆积力特征频率两两相比仅对照组和UVB+白藜芦醇差异无统计学意义(P<0.05)；各组与照后时间呈现交互效应(P<0.05)。3、HaCaT细胞经49.5mJ/cm2剂量UVB照射后,继续培养1.0h.2.0h、3.0h、 4.0h、5.0h后观察自噬,结果显示自噬细胞比例从照后1.0h的20.15±2.10%先是增长到最高50.67士7.33%,然后下降直至照后5.0h还保持在21.39士3.75%,自噬细胞比例峰值出现在照后3.0h(P<0.05)。HaCaT细胞经0mJ/cm2(对照)、9.9mJ/cm2、29.7mJ/cm2、49.5mJ/cm2剂量UVB照射后,继续培养3.0h后观察自噬,结果显示HaCaT细胞自噬比例随UVB照射剂量增加而上升,从4.13士1.02%增长到65.78±6.14%(P<0.05)。结论1、UVA和UVB可通过作用于鸟嘌呤氢键、磷酸基静电斥力、腺嘌呤碱基分子内能和腺嘌呤碱基堆积力等分子结构损伤HaCaT细胞DNA, UVB的损伤作用更大。2、白藜芦醇可通过保护HaCaT细胞DNA鸟嘌呤氢键、磷酸基静电斥力和腺嘌呤碱基堆积力等分子结构而减少UVB所致损伤。3. HaCaT细胞经49.5mJ/cm2剂量UVB照射并培养至1-5h,自噬细胞比例先上升然后下降,峰值出现在照后3h左右。HaCaT细胞经9.9～49.5mJ/cm2剂量UVB照射并培养至3.0h,自噬细胞比例随照射剂量增加而上升。