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研究背景目前,异基因造血干细胞移植(allogeneic hematopoietic stem cell transplantation, allo-HSCT)是某些恶性血液病的唯一治愈方法。急性移植物抗宿主病(acute graft-versus-host disease,aGVHD)是allo-HSCT后受者死亡的主要原因。迄今为止尚无最佳aGVHD预防方法,亟需开发更有效的预防方案。间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)因其独特的免疫调节及组织修复能力,成为allo-HSCT过程中细胞疗法的理想“候选者”。大量临床试验提示过继性输注MSCs能够预防allo-HSCT后致死性aGVHD的发生,并且能够促进造血重建。然而,MSCs的多向分化能力及其体内长期生存活性对受者远期影响不明,出于安全性考虑限制了MSCs的广泛应用。近年来研究提示胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)介导的旁分泌机制在MSCs为基础的治疗中发挥关键作用,并且越来越多的临床前及临床试验提示在组织修复及免疫调节领域,MSCs来源的外泌体及微泡有望替代MSCs发挥作用。研究目的本研究拟探讨人脐带间充质干细胞来源胞外囊泡(EVs released from human umbilical cord derived MSCs,hUC-MSC-EVs)在allo-HSCT中是否可以预防aGVHD和促进造血重建及可能的机制。研究方法及结果①Allo-HSCT小鼠模型的建立。BALB/c小鼠7.5Gy X射线全身照射后4-6小时内输注C57BL/6小鼠6×106骨髓细胞及3×106脾细胞。移植后21天左右受鼠出现明显的体重下降、活动度减少、弓背、竖毛、皮肤裸露等aGVHD临床表现。相应地,移植后1个月aGVHD靶器官：皮肤、肝脏、肠道出现典型的组织形态学改变。移植后约两个月,受鼠全部死于严重的aGVHD。② hUC-MSC-EVs的分离及鉴定。hUC-MSCs在无血清培养基中培养48小时后收集细胞培养上清,2000g离心30分钟以去除细胞及碎片。上清给予两次100000g,2小时,4℃超速离心。PBS重悬最终EVs沉淀。BCA法测定hUC-MSC-EVs蛋白浓度。透射电子显微镜观察hUC-MSC-EVs是一群直径介于30到100纳米大小的异质性球状体。③探究hUC-MSC-EVs对allo-HSCT小鼠aGVHD的预防作用。allo-HSCT第0天、第7天分别输注200μg hUC-MSC-EVsohUC-MSC-EVs输注组受鼠aGVHD临床表现减轻,靶器官组织形态学改变减轻,死亡率降低。淋巴细胞亚群检测提示hUC-MSC-EVs输注组受鼠CD3+CD8+T细胞比例及绝对值明显降低,但CD3+CD4+/CD3+CD8+T细胞比例升高。此外,hUC-MSC-EVs输注组受鼠促炎细胞因子：IL-2、TNF-α及IFN-y水平降低,抗炎细胞因子：IL-10水平增高。与此一致,体外实验提示hUC-MSC-EVs处理组丝裂原诱导的小鼠淋巴细胞增殖受抑,且细胞因子变化模式与体内实验相似。④探究hUC-MSC-EVs对allo-HSCT后小鼠造血重建的影响。allo-HSCT第0天输注200μg hUC-MSC-EVs。hUC-MSC-EVs输注组小鼠外周血象恢复时间缩短。体外实验发现hUC-MSC-EVs处理组小鼠骨髓细胞各系集落形成率增加。研究结论①成功建立了allo-HSCT小鼠模型;②差异离心法是获取hUC-MSC-EVs的有效方法;③ hUC-MSC-EVs通过调节免疫反应预防allo-HSCT后aGVHD的发生;④ hUC-MSC-EVs促进allo-HSCT后造血重建。