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溴代阻燃剂(Brominated Flame Retardant,BFR)是分子结构中含有溴原子的一类有机阻燃剂的统称,被广泛添加于日常生活的多种产品中以满足防火安全规定。研究表明,多种BFR物质具有持久污染性、生物毒性和内分泌干扰性,并在各种环境介质中存在。目前BFR已作为一类新兴的环境污染物而逐渐引起人们的关注。检测BFR类物质主要以气相、液相色谱方法为主。色谱方法可实现准确、较灵敏地定量分析,但这些方法对样品前处理过程复杂;仪器配置要求高、价格昂贵、易损;检测成本高、周期长。为克服现有检测方法的不足,建立高灵敏、高特异、高通量的新型分析方法用于定量检测环境介质中的BFR类物质,将具有重要的研究意义和广阔的应用前景。 本研究中,以四溴双酚A(Tetrabromobisphenol-A,TBBPA)和三(2,3-二溴丙基)异氰脲酸酯(Tris(2,3-dibromopropyl) isocyanurate,TBC)作为BFR代表物质,设计并合成了相应的半抗原,半抗原经红外光谱和核磁共振氢谱表征验证了分子结构。将半抗原与载体蛋白偶联,制备了TBBPA、TBC的人工免疫原和包被原。以新西兰大白兔为受体动物,经为期四个月的免疫后,从兔血中分离获得了抗TBBPA和抗TBC多克隆抗体。纯化后抗TBBPA抗体蛋白质浓度为16.19 mg/mL;抗TBC抗体蛋白质浓度为3.4 mg/mL。纯化后抗体效价均在1:100,000倍以上。 本研究中结合酶联免疫吸附技术、实时荧光定量免疫PCR和生物条形码技术,分别建立了生物素-亲和素酶联免疫吸附法(BA-ELISA)、直接竞争实时荧光定量免疫PCR(rt-iPCR)和基于rt-iPCR的间接竞争生物条形码(rt-iPCR-BCA)三种新分析方法。应用新方法检测海洋表层沉积物样品中TBBPA和TBC的含量,并将检测结果与HPLC方法比较,以判断新方法检测结果的准确性。 间接竞争BA-ELISA方法建立时,优化了各检测试剂浓度,分析了基质效应的影响。最佳条件下检测TBBPA,线性范围为0.06-5.89 ng/mL;R2=0.968;灵敏度为0.58 ng/mL,检测下限为0.03 ng/mL;检测TBC时,线性范围为0.025-39.78 ng/mL;R2=0.985;灵敏度为0.66 ng/mL,检测下限为0.0067 ng/mL。检测方法板内和板间变异系数均小于15%,说明方法重复性较好。该方法检测海洋表层沉积物样品中TBBPA和TBC的含量结果与HPLC方法相一致。样品加标回收率分别为82%-108%(TBBPA)、85%-110%(TBC);变异系数分别为1.4%-8.3%(TBBPA)、1.5%-10.6%(TBC)。此外,该方法可实现对样品的高通量检测。 建立的直接竞争rt-iPCR方法通过PCR扩增DNA来实现对抗原抗体结合反应的信号放大。最佳检测条件下,当TBBPA浓度在10pg/L-10ng/L之间时,线性关系良好;R2=0.956;检测下限为6.83 pg/L。当TBC浓度在5pg/L-10ng/L之间时,线性关系良好;R2=0.983;检测下限为2.66 pg/L。rt-iPCR方法的板内、板间变异系数均小于12%,具有良好的重复性。海洋表层沉积物样品中TBBPA和TBC的检测结果与HPLC方法相一致。同时rt-iPCR方法可实现高通量检测,可极大地缩短检测时长。样品加标回收率分别为80.4%-105.5%(TBBPA)、80%-113%(TBC);变异系数分别为2.1%-10.4%(TBBPA)、1.9%-11.7%(TBC)。与BA-ELISA方法相比,检测下限降低了千倍。 为建立检测TBBPA和TBC的间接竞争rt-iPCR-BCA免疫方法,首先将羊抗兔IgG和巯基修饰DNA标记在金纳米颗粒(GNPs)表面,成功制备了“羊抗兔IgG-GNPs-DNA”生物探针。生物探针用以识别PCR小管内壁上发生的抗原抗体反应,而其上标记的条形码DNA则用于RT-PCR扩增,以放大检测信号。与rt-iPCR方法相比,该方法可提高抗体与DNA的结合比例,从而提高了灵敏度。最佳检测条件下,检测TBBPA线性范围为1pg/L-10ng/L;R2=0.968;检测下限为1.15 pg/L。检测TBC线性范围为0.1pg/L-100pg/L;R2=0.974;检测下限为0.97 pg/L。与rt-iPCR方法相比,该方法检测下限降低了3-6倍。方法变异系数均小于10%,具有良好的重复性。应用该方法高通量地检测20个海洋表层沉积物样品,检测周期为6h,远小于HPLC方法的检测周期(80h)。检测TBBPA和TBC的加标回收率分别82%-110.5%和82%-111.3%。 建立的三种新分析方法均具有高灵敏、高特异、高通量、操作简便、检测稳定等优点。实际样品检测结果与色谱方法结果具有良好的一致性,表明建立的分析方法可用于环境样品中TBBPA和TBC的定量分析,具有良好的应用前景。