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目的:肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我国发病率和死亡率分别位居第四位和第三位的癌症“杀手”,到目前为止仍缺乏有效的防治手段。丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)慢性感染与肝癌的发生发展密切相关,但相关的分子机制仍不清楚。因此本研究拟初步探讨HCV编码的非结构蛋白NS2和NS3/4A对细胞基因组稳定性的影响,以期为HCV感染相关的HCC发病机制提供新的视角。方法:1.质粒构建:以p CMV-tag2B为载体,以HCV 2a型JFH-1株基因为模板,采用双酶切法构建HCV NS2基因的重组载体p CMV-tag2B-NS2,经酶切和DNA测序进行鉴定;2.WB和DAPI染色分析:在Huh7细胞中分别转染空载体、HCV NS2及NS3/4重组载体后,采用Western blot和/或DAPI染色分析不同药物处理(CPT、Taxol及Nutlin-3)处理时HCV蛋白对DNA损伤应答信号和凋亡的影响;3.免疫荧光检测:在U2OS细胞中分别转染空载体、HCV NS3/4A重组载体后,用免疫荧光方法检测γ-Tubulin和α-Tubulin的表达;4.流式细胞术检测:在Huh7细胞中转染HCV NS2或NS3/4A表达质粒后,流式细胞术检测病毒蛋白对细胞周期的影响;5.MTT法分析:在Huh7细胞中转染p LV-Green和p LV-Green-NS3/4A后,采用MTT法分析Taxol、Nutlin-3单独或联合处理时NS3/4A蛋白对细胞活力的影响;6.数据处理:数据统计用SPSS19.0软件处理,计量资料以均数±标准差表示,组间率的比较采用卡方检验,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.成功构建真核表达质粒p CMV-tag2B-NS2;2.p CMV-tag2B-NS2和p CMV-tag2B质粒转染的细胞凋亡率分别为(15.33±0.88)%和(4.66±0.88)%(P<0.05),表达HCV NS2蛋白的细胞周期分布与对照细胞相近(c2=0.17,P>0.05);并且表达HCV NS2蛋白的细胞中DNA损伤相关蛋白γH2AX、CHK1及DNA损伤修复蛋白RPA32表达水平较对照细胞显著升高;3.过表达HCV NS3/4A蛋白的细胞经喜树碱(CPT)处理时,磷酸化的NBS1、CHK1及RPA32的表达水平降低。4.HCV NS3/4A蛋白表达的细胞与对照细胞相比,中心体数量及异常分裂的细胞显著增多(P<0.05);HCV NS3/4A蛋白表达的Huh7细胞在Taxol诱导下增殖活性明显下降(P<0.05)。5.HCV NS3/4A蛋白表达的细胞S期减少而G2/M期增多(c2=6.21,P<0.05)。结论:1.HCV NS2蛋白可促进Huh7细胞凋亡,但对细胞周期进程无影响;2.HCV NS2蛋白可诱导DNA损伤,并激活ATR-CHK1通路活化DNA损伤应答反应;3.HCV NS3/4A蛋白可诱导DNA损伤并干扰ATR和ATM介导的损伤应答反应;4.HCV NS3/4A蛋白可诱导细胞发生中心体扩增和有丝分裂异常,增强细胞对Taxol处理的敏感性;5.HCV NS3/4A蛋白能引起细胞发生DNA损伤,且抑制其修复,造成细胞基因组不稳定。