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目的： 观察人脐带来源间充质干细胞（human umbilical cord derived mesenchymal stem cells,hu-MSC）分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicle, EV）免疫调控特性。探究经不同细胞因子处理后间充质干细胞分泌细胞外囊泡（MSC-EV）的免疫调控功能是否发生改变，并探讨其可能机制。筛选可使MSC分泌具有更强大免疫调节功能的MSC-MV的适宜条件和预处理方法，为一种新的干细胞治疗方式提供理论依据和实验基础。 方法： 本实验主要由两部分组成，第一部分为MSC-EV提取方法的确立。选取正常产妇脐带，按照既往文献报道的方法分离提取间充质干细胞，并进行传代。实验采用传代至3～6代间充质干细胞，经无血清培养基培养72h后收集培养上清。根据既往文献报道，使用EV提取的“金标准”超速离心法所提取EV的产量明显低于其他提取方法，且此方法提取EV效率低下的原因尚不明确。为探究造成超速离心法提取效率低下的原因，将所收集的培养上清经一系列低速离心及0.22μm孔径滤膜过滤等步骤去除细胞碎片及其余杂质。将所得培养上清分为两份，其中一份转移至超速离心管超速离心后收获EV并留存上清备用。使用extraPEG法提取另一份培养上清与留存的超速离心后上清中的EV。检测三组样品的总蛋白含量，形态学特征，特征性蛋白标志物，粒径大小，蛋白种类。分离人外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells，PBMC），以蛋白含量作为EV的定量指标将相同蛋白含量的样品与经conA刺激后的PBMC共培养72 h，MTT法检测PBMC的增殖活性。寻找超速离心法提取EV效率低下的原因，选取合适的EV提取方法。第二部分为探究经不同细胞因子处理后MSC-EV免疫调控功能的改变，从而筛选出可以获得更强免疫调控功能的EV的MSC预处理方法。选传代至3～6代的MSC，换无血清培养基。然后分别加入在MSC的免疫调控作用中扮演重要负性免疫调控作用的细胞因子TGF-β1或IL-10，可以显著提高MSC免疫调控作用的细胞因子IFN-γ或TNF-α。培养72h后收集培养上清并收获MSC。使用第一部分所选取的extraPEG法提取上清中EV，BCA法测其总蛋白含量。以总蛋白含量作为EV的定量指标将经过不同细胞因子处理后的MSC-EV与PBMC共培养72h，流式细胞仪检测经不同处理方式后的MSC分泌的EV的表面标志物及其对PBMC凋亡和调节性T细胞（Treg）的影响。CBA试剂盒检测共培养上清中IL4，IL6，IL10，IFN-γ，TNF-α，Th17A和TGF-β1含量的改变。通过以上方法来筛选可以获得具有强大免疫调节能力MSC-EV的细胞预处理方式，同时也从一个新角度解析MSC的免疫调控功能。 结果: 经分离和体外扩增可以从脐带中获取大量hc-MSC。使用extraPEG法可以从经过超速离心法提取EV后的MSC培养上清中提取出大量直径在40nm-120nm，具有典型的杯口状膜结构具有生物活性的EV。相比超速离心法，extraPEG法是一种简单高效的EV低速离心提取方法。经过细胞因子TGF-β1处理后的MSC分泌的EV在与PBMC共孵育后可以提高PBMC中Treg细胞比例，增加PBMC的凋亡。同时经TGF-β1处理后的MSC-EV中的TGF-β1含量减低，IL-6含量增高。相比之下IL-10对MSC分泌的EV无影响。经过细胞因子IFN-γ或TNF-α处理后的MSC表面程序死亡因子配体（programmed death ligand，PD-L1）的表达含量会发生明显上升且IFN-γ对此的提升能力更强。此外，IFN-γ还可以提高MSC表面HLA-DR的表达水平。经IFN-γ处理后的MSC分泌的EV表面PD-L1的表达量亦会随之升高，HLA-DR的表达量无明显变化,TNF-α无此种作用。IFN-γ处理后的MSC分泌的EV可以提高PBMC中Treg细胞百分比，增加PBMC的凋亡比例。此外IFN-γ和TNF-α均可以改变PBMC培养上清中多种细胞因子的含量，且经过处理后的MSC分泌的EV自身所含有的多种细胞因子也会发生改变。 结论： 使用超速离心法会造成大量EV残留于超速离心后细胞培养上清中，且残留于超离后上清中的EV的形态学结构及功能并未发生改变。经TGF-β1和IFN-γ处理MSC会使其分泌出免疫调控功能更为强大的EV。IFN-γ可以在不增加MSC-EV表面HLA-DR表达量的同时提高MSC-EV的免疫调控功能，是一种潜在的，收获具有更强大免疫调控功能MSC-EV的细胞预处理方式。