猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)引起的以新生仔猪水样腹泻、呕吐、脱水和高死亡率等为主要特征的传染病。该病最早于1970s年在英国和比利时报道,在随后的30年间,PED主要在亚洲和欧洲的多个国家流行,给养猪业带来极大的经济损失。在国内,由于TGEV、PEDV二联灭活疫苗和二联活疫苗的广泛使用,为有效控制PED的流行起到了十分重要的作用。然而自2010年年底以来,由于PEDV变异毒株的出现引起了仔猪腹泻在我国的暴发并呈现新的流行特征:发病率高、致死率高、流行广,即使疫苗免疫猪场也不能幸免,给我国养猪业造成了巨大的经济损失。2013年,PEDV变异毒株先后登陆美国、加拿大等以前从未发生过PED的美洲国家,并导致大量仔猪发病或死亡,引起了全球养猪业的恐慌。深入研究PEDV变异毒株的致病与免疫机理,研制更加安全有效的新型疫苗,已成为当前PED研究的热点。因此,本研究通过蛋白质组学方法对分离的PEDV变异毒株AJ1102株感染Vero细胞后蛋白的差异表达情况进行了分析,并且将该毒株在Vero细胞上连续传代后对不同代次病毒的毒力和免疫原性进行了评价。具体研究内容如下:1.PEDV AJ1102株感染Vero细胞的蛋白质组学研究为了了解PEDV AJ1102株感染Vero细胞后细胞蛋白表达的差异,通过同位素标记相对和绝对定量(isobaric Tags for Relative and Absolute Quantitation,iTRAQ)技术,结合液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS),对PEDV感染Vero细胞的蛋白表达情况进行了鉴定和分析。共有49个蛋白表达有显著差异,其中8个蛋白表达上调、41个蛋白表达下调。利用生物信息学软件对差异表达蛋白的亚细胞定位和生物学功能进行了聚类分析,并绘制了蛋白互作的网络图,发现这些差异表达的蛋白与细胞凋亡、信号转导及压力应激反应等多种生物进程通路有关。推测PEDV可能通过调控细胞凋亡和ERK信号通路来促进病毒的复制。为了检验蛋白质组学鉴定结果的可信度,通过Western blot方法进一步对HSDL2,14-3-3 gamma和HSP27的表达进行了检测,结果与蛋白质组学鉴定的结果基本上一致。研究结果为更好的了解PEDV感染宿主后的致病机制提供了数据。2.PEDV AJ1102株的传代与不同代次的全基因组序列分析将PEDV AJ1102株在Vero细胞上连续传至第120代,并对P11、P40、P70、P100和P120进行了全基因组测序分析,这5个代次病毒的全基因组序列的长度分别为28042 bp、28042 bp、28054 bp、28051 bp和28051 bp,序列比对发现在传代过程中病毒非编码区、非结构蛋白基因及S基因的突变率要明显高于其它基因的突变,并且突变主要发生在P1至P11的传代过程中;值得注意的是在传代过程中出现了两处特征性的突变,其中一处是在P70代出现的:在S基因的3087-3088位碱基之间插入了 12个碱基,导致其编码的S蛋白在1269-1270氨基酸之间有4个氨基酸(AIVD)的插入;在P100代中出现了另一特征性的变异:M基因669-671位碱基缺失(TTT),导致M蛋白223位氨基酸由组氨酸突变为谷氨酰胺和224位氨基酸(亮氨酸)的缺失,并且这两处特征性的变异一直到P120均稳定存在。3.PEDV AJ1102株传代后不同代次的致病性分析将PEDVAJ1102株P11,P40,P70,P100和P120 5个代次的病毒进行3～5日龄和24～26日龄仔猪的致病性分析,动物试验结果表明:P11和P40引起80%以上的的3～5日龄和24～26日龄仔猪发病,且P11攻毒组3～5日龄仔猪1头发病死亡,P70,P100和P120这3个代次的攻毒组不引起3～5日龄和24～26日龄仔猪发病,说明病毒在P70以后毒力已经明显减弱。4.PEDV AJ1102株不同代次的免疫原性分析PEDVAJ1102株P40、P70、P100和P120病毒经肌肉免疫仔猪后发现:P70免疫组产生中和抗体的时间最早,到免疫后21日,所有免疫猪的中和抗体均不低于1:19.0(1:19.0～1:27.0);而P100和P120免疫组仔猪在免疫后21日抗体水平(均不高于(1:11.3)明显低于P70免疫组,说明病毒传至P100后诱导中和抗体的能力有所下降。虽然P100和P120诱导的中和抗体要低于P70,但也能保护免疫仔猪抵抗PEDV强毒的攻击,这可能是由于病毒免疫后诱导的细胞免疫在抵抗强毒攻击中起到了重要的作用。5.PEDV AJ1102株S基因的插入对毒力的影响由于PEDV AJ1102株传至第70代时,其毒力显著下降,而P70与P11和P40相比基因组的一个特征性变异是在S基因1269-1270之间有4个氨基酸(AIVD)的插入,且这4个氨基酸的插入在随后的传代中一直稳定存在,推测这4个氨基酸的插入可能是引起病毒毒力下降的原因。为了证实这一点,首先通过对各代次病毒S基因的扩增测序发现4个氨基酸的插入最早出现在P55,于是通过克隆获得了无4个氨基酸插入的克隆毒P55和有4个氨基酸插入的克隆毒P55-In,经动物实验证实,与P11相比P55的毒力有所下降染,但3-5日龄仔猪仍有较强的致病性,而P55-In对3-5日龄仔猪不致病,由此说明S基因4个氨基酸的插入是导致病毒毒力减弱的一个重要原因。6.PEDV AJ1102株M基因的缺失对免疫原性的影响为了确定PEDV AJ1102株M基因中669-671位碱基的缺失是否影响病毒的免疫原性,首先通过RT-PCR扩增和测序确定了 3个碱基的缺失最早是在第82代出现的,于是通过克隆分别获得了碱基未缺失的克隆毒P82和3个碱基缺失的克隆毒P82-Del,并将这两个克隆毒分别传到100代后对其免疫原性进行了比较,结果在免疫后7d,P70、P82、P100免疫组个别仔猪产生了低水平的中和抗体,到免疫后21d所有免疫猪的抗体水平均不低于1:19.0;而P82-Del和P100-Del免疫组仔猪产生中和抗体时间相对较晚,免疫后14d才有部分仔猪产生了低水平的中和抗体,到免疫后21d也未见明显上升。但所有免疫组均能保护仔猪抵抗PEDV AJ1102株强毒的攻击,说明M基因中3个碱基的缺失对病毒的免疫原性有一定的影响,同时也说明病毒诱导的其它免疫反应在保护免疫猪中也起着非常重要的作用。