初级纤毛是一种结构特殊、功能复杂的细胞器,可感知细胞外机械刺激和化学信号变化,并协助其转导至细胞内部。初级纤毛遍布人体多处器官细胞表面。小鼠3T3-L1成纤维细胞在接触抑制后可以形成初级纤毛,是研究纤毛相关疾病的良好细胞模型。细胞在体内并不是独立存在的,其周围存在大量的细胞外基质。细胞外基质一方面对细胞起到粘附支持作用,另一方面也影响细胞内的信号转导。而Ⅰ型胶原是细胞外基质的主要成分,它大量存在于成纤维细胞所在的真皮组织。初级纤毛表面也存在胶原受体,如integrins,但胶原对初级纤毛的影响知之甚少。本研究使用Ⅰ型胶原分子包被培养3T3-L1细胞,体外模拟细胞体内微环境,研究胶原对细胞形态学以及初级纤毛结构的影响。鬼笔环肽染色发现,与未包被组细胞的不规则圆形相比,3T3-L1细胞在Ⅰ型胶原上呈现出明显的成纤维状,但两组之间并无明显的生长差异。并且,Ⅰ型胶原培养能够促进融合状态3T3-L1细胞的纤毛生长。细胞外基质的存在能够影响很多细胞内信号通路,包括调节细胞内物质循环以及生命活动的自噬通路,以及负责感知细胞外机械压力的YAP通路,因此我们接下来分别对这两条通路进行了研究。Ⅰ型胶原可以下调组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的表达而抑制3T3-L1细胞的自噬,从而发挥促进初级纤毛生长的作用。使用siRNA抑制LC3表达可以进一步促进Ⅰ型胶原诱导的初级纤毛生长。而在YAP通路的研究中,我们发现Ⅰ型胶原包被培养可以促进YAP核内表达。而加入YAP抑制剂Verteporfin处理细胞或者使用特异性siRNA干扰YAP蛋白的表达后,Ⅰ型胶原诱导的初级纤毛生长被逆转。细胞外基质的影响广泛现于肿瘤细胞的侵袭和迁移过程,因此我们接下来考察Ⅰ型胶原包被培养体系以及其所增强的纤毛生长对于细胞迁移的影响。划痕实验和Transwell实验结果显示,Ⅰ型胶原包被培养促进3T3-L1细胞的迁移;而转染特异性siRNAs敲除纤毛相关蛋白IFT88或者YAP蛋白后,Ⅰ型胶原诱导的细胞迁移均被逆转。以上结果表明,Ⅰ型胶原可以促进初级纤毛生长,进而促进细胞迁移;在Ⅰ型胶原调节纤毛生长的过程中,HDAC6介导的细胞自噬被抑制,而YAP通路被活化。作为感知外界环境变化的细胞器,初级纤毛除了受到细胞外基质的调节,还可能受到各种药物成分的调节。有研究发现初级纤毛结构异常与神经退行性疾病、心脏病和胰岛素抵抗型糖尿病等多种人类先天性疾病密切相关。本实验室前期研究发现菊科植物水飞蓟中提取的黄酮木脂素类药物水飞蓟宾对LPS和Aβ诱导的学习记忆障碍具有保护作用,可改善异丙肾上腺素引起的心肌细胞损伤和逆转胰岛β细胞的死亡,水飞蓟宾还可以抑制3T3-L1细胞脂肪形成。那么水飞蓟宾这些作用的发挥是否与初级纤毛相关,这引起了我们的关注。因此,我们接下来研究水飞蓟宾对初级纤毛的调节作用及机制。实验结果表明,50 μM水飞蓟宾使融合的3T3-L1细胞轮廓变清晰,初级纤毛变短;100 μM时细胞形态皱缩,伴随着初级纤毛消失。水飞蓟宾被报道能够影响细胞的自噬水平,而自噬又与纤毛长度密切相关,因此我们接下来考察自噬通路是否参与水飞蓟宾对纤毛的调节。研究发现,与Ⅰ型胶原结果相反,50 μM水飞蓟宾作用于融合状态的3T3-L1细胞24 h后,自噬相关蛋白表达量升高,纤毛相关蛋白表达量降低。使用siRNA抑制LC3表达后,自噬水平降低,水飞蓟宾诱导的初级纤毛长度变短得到逆转。进一步,我们发现水飞蓟宾对于自噬的调节也是由HDAC6所介导的。我们转染特异性siRNA抑制HDAC6表达,降低水飞蓟宾诱导的自噬,结果发现初级纤毛的生长被促进。因此,水飞蓟宾可以通过促进HDAC6介导的自噬来下调3T3-L1细胞初级纤毛的生长。综合以上结果,我们在对融合状态3T3-L1细胞初级纤毛的研究中发现,细胞外基质Ⅰ型胶原能够通过抑制HDAC6介导的自噬以及促进YAP入核来促进初级纤毛的生长,进而促进细胞迁移;而黄酮类药物水飞蓟宾通过促进HDAC6介导的自噬来抑制初级纤毛的生长。