论文部分内容阅读
目的 构建带有绿色荧光蛋白表达人野生型XPD基因重组质粒pEGFP-N2-XPD，并将其稳定转染至人肝癌细胞株Hep3B细胞，观察转染后细胞内XPD，HBx，Cdk7等基因的表达变化以及对细胞生长的影响。探讨XPD基因与HBx，Cdk7的相互作用，以及细胞周期和凋亡机制。 方法 将表达绿色荧光蛋白并含有人类全长野生型XPD的pEGFP-N2-XPD重组体质粒稳定转染入肝癌细胞Hep3B中，选择性培养基筛选单克隆稳定转染重组质粒的Hep3B细胞(Hep3B-pEGFP-N2／XPD)和稳定转染空载质粒的Hep3B细胞(Hep3B-pEGFP-N2)，并将Hep3B细胞作为空白对照。利用荧光显微镜观测绿色荧光蛋白表达，用RT-PCR、Western blot法检测转染XPD基因后细胞内XPD，HBx，Cdk7的表达量变化，并使用MTT法TUNEL法以及流式细胞仪检测细胞的增殖凋亡以及细胞周期变化。 结果 1、免疫荧光显微镜下，Hep3B-pEGFP-N2：和Hep3B-pEGFP-N2／XPD细胞中可观察到绿色荧光蛋白表达，说明pEGFP-N2空载质粒以及pEGFP-N2-XPD重组质粒成功转染；2、RT-PCR检测：Hep3B-pEGFP-N2／XPD细胞与Hep3B和Hep3B-pEGFP-N2两对照组相比，HBx mRNA表达明显降低(P＜0.001)，XPD mRNA表达明显增高(P＜0.01)，Cdk7 mRNA表达明显降低(P＜0.001)；3、MTT检测示：Hep3B-pEGFP-N2／XPD细胞细胞增殖率较对照组减弱(P＜0.05)；TUNEL检测示Hep3B-pEGFP-N2／XPD较对照组细胞凋亡明显增加(P＜0.01)；流式细胞仪检测：Hep3B-pEGFP-N2／XPD细胞进入S期出现障碍，停滞在GO+G1期的细胞增多，细胞凋亡率逐渐增加。4、Western blot检测：Hep3B／pEGFP-N2-XPD细胞XPD蛋白表达量升高，Cdk7蛋白相对表达量均比两对照组低，差异有统计学意义(P＜00001)。