拟南芥鸟苷酸交换因子——SWAP70的功能研究

来源 :兰州大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:l190207100
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小 G蛋白作为分子开关参与调控植物中的许多细胞过程,包括植物的生长发育、响应外界胁迫以及植物免疫,其活性主要受鸟苷酸交换因子(GEF)的调控。SWAP-70(Switch-associated protein70),是磷酸酰基醇-3,4,5-三羟甲基氨基甲烷磷酸盐(PtdIns(3,4,5)P3)-依赖的一种鸟苷酸交换因子,大小为70-kDa,近些年在动物界中被广泛研究,主要参与到动物细胞免疫中,调控 F-actin细胞骨架的重组,且对哺乳动物细胞的活化、迁移、粘附和入侵起着关键作用。但是在植物中对于SWAP70的研究甚少,在拟南芥中被研究报道的文献更是少之又少。  本文以拟南芥为研究材料,通过构建蛋白同源进化树、实时定量 PCR和半定量PCR、共聚焦显微技术及突变体表型分析等方法,研究拟南芥基因AtSWAP70的功能,试图探讨SWAP70作为一个鸟苷酸交换因子活化小G蛋白的作用机制,阐释其参与囊泡运输、各类胁迫响应等信号通路,进一步揭示基因AtSWAP70参与拟南芥的生长发育及响应外界各种胁迫的机制,并取得以下结果:  1)发现了SWAP70可能起源于单子叶植物和双子叶植物分化的早期。根据蛋白同源进化树初步分析,单子叶植物和双子叶植物中 SWAP70的蛋白序列分属两个类群,说明SWAP70可能起源于以上两者的分化早期。  2)证实了拟南芥基因AtSWAP70的突变体232为功能缺失突变体。半定量和实时定量PCR分析表明,AtSWAP70的突变体232的T-DNA插入位点为第四个内含子上,且使基因AtSWAP70被完全敲除。  3)阐释了AtSWAP70参与植物囊泡运输过程,且在液泡前体/多囊泡复合小体(prevacuolar compartment/multivesicular body,PVC/MVB)和反面高尔基体管网状结构(trans-Golgi network,TGN)等细胞器/结构上发挥作用。亚细胞定位分析表明,稳定转化的拟南芥细胞中,点状的AtSWAP70-GFP信号主要聚集在细胞膜附近;瞬时转导的烟草细胞中,点状的AtSWAP70-YFP信号和PVC/MVB markers能很好的共定位,与TGN marker少数共定位,与液泡marker不能发生共定位现象,说明 AtSWAP70与囊泡运输过程有密切关系,且主要定位于PVC/MVB和TGN上。  4)阐明了AtSWAP70广泛参与到各个组织的细胞过程。实时荧光定量PCR分析表明,AtSWAP70在根、茎、叶、花、花苞及花粉中均有表达,说明AtSWAP70是组成型表达蛋白,在各个组织中都发挥其功能。  5)发现了基因AtSWAP70能够在短时间内快速响应多种非生物胁迫(NaCl、ABA及H2O2等)和生物胁迫(flg22、elf18)。实时荧光定量PCR分析表明,在各种胁迫处理中,NaCl、ABA、H2O2、flg22和 elf18均能在短时间内明显上调或下调基因SWAP70的表达。  6)揭示了AtSWAP70更倾向于响应拟南芥非生物胁迫,尤其是特异地参与响应NaCl盐胁迫和外源ABA激素。突变体表型分析实验表明,在NaCl盐胁迫以及外源ABA激素处理下,突变体232较野生型更为敏感,且存在浓度依赖性。而在KCl盐胁迫下,突变体232和野生型无较大差异;在抗病原菌(Pst DC3000和Pst DC3000 AvrRpt2)实验中,野生型和突变体232的抗病性差异不显著。  综上所述。AtSWAP70作为一个鸟苷酸交换因子,参与调控植物的囊泡运输过程、非生物胁迫响应途径、ABA信号通路以及拟南芥的免疫响应过程。本文研究结果为阐明拟南芥鸟苷酸交换因子参与植物囊泡运输和适应外界胁迫的机制提供了理论依据。
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