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第一部分新型自组装肽纳米纤维水凝胶支架材料的制备及理化性质分析目的设计并制备了一种仅由D型氨基酸构成的新型自组装肽(self-assembling peptide,SAP):D-RADA16。采用圆二色谱仪、透射电镜、流变仪对两种SAP L-RADA16及D-RADA16进行表征,了解其结构是否互为手性对映体,D-RADA16微观结构是否可形成纳米纤维;研究二者的机械性质。并将两种SAP进行了蛋白酶K降解试验,比较其生物学稳定性。以期研发兼有良好生物学活性及稳定性,并且可以批量化生产的骨修复材料。方法SAP材料经商业合成,采用高效液相色谱仪(high performance liquid chromatography,HPLC)分析纯度,质谱仪(mass spectrometer,MS)分析分子量;采用圆二色谱(circular dichroism,CD)了解两种SAP L-RADA16及D-RADA16的二级结构;采用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)观察两种SAP的超微结构;采用流变仪检测两种SAP L-RADA16和D-RADA16的流变学性质。采用蛋白酶K消化两种SAP,再通过HPLC检查残余肽浓度。结果HPLC分析得出L-RADA16及D-RADA16的纯度分别为95.535%及95.9016%,MS分析得出两种RADA16的相对分子质量均为1712.77。CD分析显示D-RADA16与L-RADA16的CD光谱几乎呈镜像,提示二者为手性对映体。TEM图像显示:D-RADA16在水溶液中可自组装形成有序的纳米纤维,其和L-RADA16形成的纳米纤维直径分别为13.52±2.94 nm及16.34±6.13 nm。当D-RADA16的浓度为5mg/ml时,整个振动频率范围储能模量G’均大于损耗模量G’,说明此时D-RADA16具有凝胶的机械性能;而当D-RADA16的浓度为2.5mg/ml时,整个振动频率范围G’与G’的值都很低,说明此时D-RADA16仍为液体。对于L-RADA16的流变学检测也得出类似的结果。蛋白酶K消化2 h和6 h后,D-RADA16残余量约75%和60%;而L-RADA16残余量少于25%和8%。消化24 h后,D-RADA16残余量仍大于50%;而L-RADA16的残余量不足6.5%。结果说明与L-RADA16相比,D-RADA16对蛋白酶K有较强的抵抗能力。结论两种SAP L-RADA16及D-RADA16的分子排列及二级结构互为手性对映体。在水溶液中,D-RADA16可形成有序的纳米纤维网状支架结构。在相对高浓度下(5 mg/ml),两种手性SAP在水溶液中可以形成凝胶;在相对低浓度下(2.5 mg/ml),两种手性SAP在水溶液中仍保持液体。也说明两种手性SAP D-RADA16与L-RADA16的机械性质非常类似。与其手性对映体L-RADA16相比,D-RADA16具有更好的生物学稳定性。第二部分新型自组装肽纳米纤维水凝胶支架材料的生物相容性及安全性分析目的评价D-RADA16的生物相容性及安全性,为此材料的临床推广应用提供试验依据。方法根据GB/T 16886.1-2011/ISO 10993-1:2009《医疗器械生物学评价标准》,选取体外细胞毒性试验、全身急性毒性试验、皮内刺激试验、溶血试验、热源试验、微核试验评价D-RADA16的生物相容性。结果细胞毒性试验中,材料共培养组相对增殖率(relative growth rate,RGR)大于90%,细胞毒性为1级,材料无细胞毒性。溶血试验结果显示生物材料D-RADA16的溶血率为0.96%,符合<5%的国家标准。各组小鼠活动正常,7 d内小鼠无死亡,各组动物未见中毒症状或不良反应,7 d后各组小鼠体质量日平均增加差异无统计学意义(P>0.05)。7 d后处死动物,肝、脾、肾大体观察和HE染色未见异常。热原试验显示3只动物体温升高最高为0.5oC,升高的总数为1.2oC,符合<1.4oC的国家标准。皮内刺激试验显示兔各时相点注射肽溶液后原发性刺激指数均为0分。遗传毒性试验显示各试验组与阴性对照组微核率差异无统计学意义(P>0.05);各试验组与阳性对照组微核率差异有统计学意义(P<0.01),材料未见明显致突变性。结论新型纳米生物支架材料D-RADA16无细胞毒性,无溶血作用,无急性毒性,无致热原性,无皮肤刺激性,无遗传毒性,具有良好的生物安全性和生物相容性。为材料进一步的细胞生物学研究及临床应用提供了理论依据。第三部分自组装肽纳米纤维水凝胶支架对大鼠骨髓间充质干细胞生物学活性的影响目的提取原代大鼠骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells,BMSCs)作为种子细胞,使细胞在SAP纳米纤维支架材料上形成三维培养体系,比较D-RADA16形成的纳米纤维支架是否具有与L-RADA16类似的生物学活性作用,即促进细胞粘附、增殖和迁移。为D型SAP的应用开辟了新思路,为下一步的活体内研究和临床应用于骨组织再生提供前期实验依据。方法取4周龄SD大鼠,采用全骨髓培养法获取BMSCs,取生长良好的第3-4代BMSCs用于后续试验。采用MTT细胞增殖试验评估种植在SAP水凝胶表面的细胞分别培养3 d、5 d、7 d后的增殖率。通过细胞培养小室将细胞种植在SAP水凝胶上,三维共培养7 d后,采用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)染色了解细胞迁移进入水凝胶支架的情况。结果MTT试验结果说明,3 d时,在相同浓度下,D型和L型两种SAP支架对细胞增殖率的影响无统计学差异(P>0.05)。在1.25 mg/ml及2.5mg/ml的低浓度下,细胞增殖率与常规二维培养(对照组)相比无统计学差异;在5 mg/ml及10 mg/ml的较高浓度下,细胞增殖率与对照组相比有统计学差异(P<0.05)。进一步研究发现5mg/ml与10 mg/ml相比,细胞增殖率的无统计学差异(P>0.05)。从而得出5mg/ml是促进细胞增殖的最佳浓度,因此选择5mg/ml行后续试验。在5mg/ml时,培养5 d时,两种手性SAP支架材料分别与对照组比较,细胞增殖率有统计学差异(P<0.05)。培养7 d时,两种手性SAP支架材料与对照组比较,细胞增殖率无统计学差异(P>0.05)。细胞迁移试验显示,培养7 d后,细胞迁移进入水凝胶支架L-RADA16和D-RADA16的距离分别是285μm和186μm。结果说明两种手性SAP支架材料均可促进细胞迁移进入三维纳米纤维支架材料中。结论新型SAP支架材料D-RADA16可构建细胞培养的三维培养体系。D-RADA16具有与其手性对映体L-RADA16类似的生物学活性作用,可促进大鼠BMSCs的增殖和迁移。具有良好的临床应用前景。